Charakterisierung prädiktiver molekularer Biomarker für die Aktivität von therapeutischen anti-EGFR Antikörpern

Abstract

Der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) ist eine Rezeptor-Tyrosinkinase, die sowohl in Wachstum und Differenzierung von Zellen als auch in der Tumorprogression eine Rolle spielt. Derzeit sind sieben EGFR-Liganden bekannt, darunter der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), der transformierende Wachstumsfaktor (TGFA), Amphiregulin (AREG) und Epiregulin (EREG), die mit unterschiedlicher Affinität den EGFR binden und aktivieren. Die Ligandenbindung und somit die Aktivierung des EGFR kann durch anti-EGFR monoklonale Antikörper (mAb) blockiert werden. Dabei ist das Ansprechen auf mAb nicht nur von der Expression des EGFR abhängig sondern auch von Mutations- und Expressionsstatus weiterer Biomarker, die in der EGFR-Signaltransduktion eine Rolle spielen. In dieser Arbeit wurde daher der Einfluss folgender potentieller Biomarker auf die Sensitivität von Zellen gegen die therapeutischen anti-EGFR mAb Cetuximab, Matuzumab, Panitumumab und Nimotuzumab in vitro untersucht: (1) der EGFR-Polymorphismus R521K, (2) die EGFR-Liganden EGF, TGFA, AREG und EREG, (3) ErbB3 und (4) KRAS. Zur Untersuchung des EGFR-Polymorphismus R521K wurden stabil transfizierte Modellzelllinien (NIH3T3) generiert, die entweder humanen EGFR 521K oder humanen EGFR 521R exprimierten. In Proliferationsassays konnte beobachtet werden, dass EGFR 521K-Zellen im Vergleich zu EGFR 521R-Zellen zwar langsamer wuchsen, dafür aber besser auf Ligandenstimulation ansprachen. Gleichzeitig wurde die Proliferation und EGFR-Signaltransduktion der EGFR 521K-Zellen durch therapeutische anti-EGFR mAb effektiver inhibiert. Microarray-Analysen zeigten, dass vor allem regulatorische Zellzyklusgene bei EGFR 521K-Zellen stärker exprimiert wurden. In den Modellzelllinien (siehe oben) wurde der Effekt der EGFR-Liganden auf Proliferation und EGFR-Signaltransduktion sowie auf die Sensitivität der Zellen gegen die therapeutischen mAb untersucht. Die Liganden EGF/TGFA einerseits und die Liganden AREG/EREG andererseits hatten ähnliche Effekte auf Proliferation und Signaltransduktion. So vermittelten AREG und EREG geringeres adhäsionsunabhängiges Wachstum und eine geringere EGFR-Phosphorylierung als EGF und TGFA. Ebenso wurde das Ansprechen der Zellen auf die therapeutischen Antikörper stark von dem Vorhandensein bestimmter Liganden beeinflusst. Unter dem Einfluss von AREG und EREG hemmten die mAb effektiver Proliferation und Signaltransduktion als unter dem Einfluss von EGF und TGFA. Prinzipiell inhibierten Cetuximab und Panitumumab Proliferation und Signaltransduktion stärker als Matuzumab, und Nimotuzumab hatte den geringsten inhibitorischen Effekt. Zudem wurde in dieser Arbeit der Einfluss von ErbB3 untersucht, indem Modellzelllinien, die EGFR oder EGFR und ErbB3 exprimierten, mit EGFR-Liganden und anti-EGFR mAb behandelt wurden. Dabei konnten keine Unterschiede in der Signaltransduktion zwischen EGFR- und EGFR/ErbB3-exprimierenden Zellen festgestellt werden, was darauf hinweist, dass die durch EGFR/ErbB3-Dimere induzierte Signaltransduktion durch anti-EGFR Antikörper inhibiert werden kann. Schließlich wurde auch der Einfluss verschiedener KRAS-Mutationen auf das Ansprechen von Zellen auf anti-tumorale Therapie sowie EGFR-Liganden untersucht. Dabei zeigte sich, dass Zellen, die verschiedene KRAS-Mutationen exprimierten, unterschiedlich auf Cetuximab ansprachen, wobei KRAS Wildtyp-Zellen die Cetuximab-sensitivsten Zellen darstellten. Dagegen beeinflussten die KRAS-Mutationen das Ansprechen der Zellen auf das Chemotherapeutikum Oxaliplatin kaum; mit Ausnahme der KRAS (G12V)-Mutante reagierten alle Zellen ähnlich sensitiv auf Oxaliplatin-Behandlung. Zusammenfassend zeigen die Untersuchungen, dass die therapeutischen mAb Cetuximab, Matuzumab, Panitumumab und Nimotuzumab unterschiedliches Potenzial haben, Proliferation und EGFR-Phosphorylierung zu inhibieren. Während sich die Expression von ErbB3 nicht auf die Aktivität der mAb auswirkte, scheint das inhibitorische Potenzial der mAb von den EGFR-Liganden, dem EGFR-Polymorphisums R521K und dem KRAS-Mutationsstatus abhängig zu sein.

The epidermal growth factor receptor (EGFR) plays a major role in regulation of a variety of cellular responses, as proliferation, differentiation, motility and development and also tumor progression. Activation of the EGFR is initiated by binding of ligand growth factors [e.g. epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor alpha (TGFA), amphiregulin (AREG) and epiregulin (EREG)] to the extracellular domain of the receptor. Anti-EGFR monoclonal antibodies binding the extracellular region of EGFR have been developed to inhibit oncogenic EGFR signaling. Clinical response to anti-EGFR mAb is dependent on expression of the EGFR receptor and/or its ligands and the mutation status of biomarkers that are relevant in the EGFR signaling network. The scope of this study was to investigate differential effects of potential biomarkers (the EGFR polymorphism R521K, the EGFR ligands EGF, TGFA, AREG and EREG, the ErbB3 receptor and the KRAS mutation status) on the ability of the therapeutic anti-EGFR antibodies cetuximab, matuzumab, panitumumab and nimotuzumab to block EGFR ligand induced signaling and proliferation. Isogenic NIH3T3 mouse fibroblasts were generated stably expressing human EGFR 521K or human EGFR 521R. Cells were treated with human EGFR ligands in different combinations with anti-EGFR antibodies. Cellular proliferation under two- and three-dimensional growth conditions and EGFR signaling was analyzed. EGFR 521K cells were shown to be more sensitive to EGFR ligands and anti-EGFR mAb. Genome-wide expression analysis revealed a differential regulation of cell cycle genes in EGFR 521K and EGFR 521R cells. The stably transfected NIH3T3 cells were also used to investigate different effects of EGFR ligands on proliferation and EGFR signaling. EGF and TGFA exhibited similar effects, inducing strong three-dimensional growth and strong EGFR phosphorylation whereas AREG and EREG had weak effects on three-dimensional growth and EGFR phosphorylation. The anti-EGFR antibodies differed in their ability to inhibit EGFR ligand induced cellular proliferation, EGFR phosphorylation and phosphorylation of downstream mediators, with cetuximab and panitumumab being more potent than matuzumab and nimotuzumab. The inhibitory effect of the antibodies varied with the respective EGFR ligands used for stimulation. Cells treated with AREG and EREG were more likely to respond to mAb than cells incubated with EGF or TGFA. In order to study the effect of ErbB3 in EGFR signal transduction cells stably expressing EGFR or EGFR and ErbB3 were treated with EGFR ligands and with anti-EGFR mAb. No differences could be detected in inhibition of EGFR-downstream molecules, indicating that EGFR/ErbB3 signaling can be inhibited by anti-EGFR mAb. Furthermore, the influence of different KRAS mutations on response to antitumoral therapy was investigated in isogenic SW48 cells stably expressing KRAS wild-type or various common KRAS mutations. Sensitivity of cells on cetuximab was dependent on the KRAS mutation status with KRAS wild-type cells being the most sensitive. In contrast, treatment of cells with the chemotherapeutic agent oxaliplatin resulted in strong inhibition of cell growth with the exception of G12V mutant. In conclusion, cetuximab, matuzumab, panitumumab and nimotuzumab have different characteristics with regard to their potential to inhibit EGFR signaling and EGFR-mediated proliferation. While the presence of ErbB3 has no impact on the inhibitory potential of the tested anti-EGFR antibodies, the activity of the antibodies appears to depend on the EGFR ligand used for stimulation, the EGFR polymorphism R521K and the KRAS mutation status.