Insights into Anticodon Nuclease Toxicity and Rescue by tRNA Repair in vivo

Abstract

A group of cytotoxic bacterial and fungal endoribonucleases targets the anticodon loop of specific tRNAs. These anticodon nucleases (ACNases) produce 2',3'-cyclic phosphate and 5'-hydroxyl termini at their specific cleavage sites reminiscent of the first step in metal-independent general acid-base catalysis by RNase A. Despite their similarities, ACNases share no unifying homology in their primary structures. The presently identified ACNases can be subdivided into bacterial toxin-antitoxin ACNases (VapC and colicins E5 and D), bacterial intracellular ACNases (PrrC and RloC) and fungal ACNases (subunits of Kluyveromyces lactis and Pichia acaciae killer toxins). My studies were oriented towards increasing insight into ACNase structure function-relationships and the capacity of tRNA damage repair to overcome ACNase toxicity. Initially, the tRNAGlu (UUC) specific ACNase gamma-toxin of K. lactis had been used as a tool to study tRNA repair enzymes. In a subsequent study, the ribonuclease of gamma-toxin became the focus of an extensive mutational analysis aimed to identify candidate residues for RNase A like catalysis. I investigated whether the same tRNA repair enzymes that protect Saccharomyces cerevisiae from gamma-toxin can also protect against Pichia acaciae killer toxin. The ACNase subunit of this toxin (PaT) cleaves tRNAGln at two possible positions. Incision at one position, or nucleotide excision by cleavage at both positions, depends on PaT gene dosage and S. cerevisiae genetic background. PaT dosage and modification state of the target tRNA also influence if rescue by repair can be successful. After the discovery that intracellular expression of PrrC is toxic to S. cerevisiae, I focused on the mutational analysis of tRNALys specific E. coli PrrC. This was followed by characterization of the in vivo toxicity and the finding that expression of PrrC is fungicidal, not fungistatic. PrrC’s ACNase has been proposed to reside in the C-terminal domain. The N-terminal domain of PrrC is homologous to the well-characterized nucleotide binding domain (NBD) / NTPase domain of members of the ABC superfamily. I also addressed whether the proposed domains of PrrC both contribute to ACNase activity and whether the N terminal NBD-like domain is truly related to the ABC superfamily. Expression of separate domains is not toxic in trans and mutations in the predicted active site of either domain abolish PrrC activity in yeast in vivo. Assessing the dominant negative effect of PrrC-Ala mutants, I found evidence for in vivo oligomerization of PrrC. In addition to E. coli PrrC, I investigated the toxicity of PrrC homologs encoded in other bacteria, in order to address whether cytotoxicity and ACNase activity are a general property of this protein family. Streptococcus mutans PrrC is fungicidal and bactericidal. Surprisingly, the close homolog of E. coli PrrC from Neisseria meningitides was non-toxic both in E. coli and yeast. Further investigation of this finding by generation of PrrC chimeras and homology-guided mutational analysis of N. meningitides PrrC identified a R316W gain-of-toxicity mutant. I characterized the toxicity of this mutant in vivo in yeast and found that it is less toxic than E. coli PrrC, but displays the same specificity for tRNALys. The R316W mutant of N. meningitides PrrC thus allowed the study of repair of PrrC tRNA damage in vivo. From these investigations of ACNase toxicity it becomes evident that S. cerevisiae is susceptible to tRNA damage, as its endogenous tRNA ligase Trl1 cannot counteract the tRNA damage inflicted. New aspects of tRNA repair became apparent when archaeal, human and E. coli RtcB proteins were identified as RNA ligases. Archaeal and human RtcB could function in a tRNA splicing pathway. However, the biological role of bacterial RtcB remains unclear. To begin to understand the role of E. coli RtcB, I investigated if it can function as a ligase in yeast tRNA splicing and if it is capable of repairing ACNase tRNA damaged in vivo. E. coli RtcB is sufficient to complement lethal TRL1 deletion in S. cerevisiae and it also protects from PaT ACNase toxicity in trl1 deleted cells.

Eine Gruppe zytotoxischer Endoribonukleases von Bakterien und Pilzen richtet sich gegen die Anticodonschleife spezifischer tRNAs. Diese Anticodonnukleasen (ACNasen) hinterlassen 2',3'-zyklisches Phosphate and 5'-hydroxyl Termini an ihren jeweiligen Schnittstellen, welche auch nach dem ersten Schritt der Metall-unabhängigen Säure-Base Katalyse von RNase A auftreten. Trotz dieser Ähnlichkeiten besteht keine vereinende Homologie unter den Primärstrukturen der ACNasen. Die derzeit bekannten ACNasen lassen sich in bakterialle Toxin-Antitoxin ACNasen (VapC und Colicine E5 und D), bakterielle intrazelluläre ACNasen (PrrC und RloC) und ACNasen von Pilzen (Untereinheiten der Killertoxine von Kluyveromyces lactis und Pichia acaciae) unterteilen. Meine Promotionsstudien haben neue Einblicke in den Zusammenhang von Struktur und Funktion von ACNasen gewährt. Zusätzlich habe ich untersucht inwiefern tRNA Reparaturenzyme die Toxizität von ACNasen überwinden können. Die spezifisch gegen tRNA Glu (UUU) gerichtete ACNase gamma-toxin von K. lactis wurde bereits als Hilfsmittel zum Studium von tRNA Reparaturmechanismen verwendet. In einer darauf folgenden Studie, wurde die Ribonucleaseaktivität von gamma-toxin in einer ausführlichen Mutationsanalyse unterzogen, um katalytischen Aminosäurereste in RNase A-artiger Katalyse zu identifizieren. Ich habe untersucht, ob die gleichen tRNA Reparaturenyzme, welche Saccharomyces cerevisiae vor gamma-toxin schützen, auch gegen das Killertoxin von Pichia acaciae wirken können. Die ACNase Untereinheit dieses Toxins (PaT) spaltet tRNAGln in zwei Positionen der Anticodonschleife. Der Schnitt an einer, oder Entfernung von Nukleotiden durch Spaltung an beiden Stellen, hängt von der Gendosis PaTs als auch dem genetischen Hintergrund der PaT exprimierenden S. cerevisiae Zellen ab. Meine Studien zeigten, dass PaT Dosis und der Modifikationsstatus der angegriffenen tRNA auch Reparatur der tRNA beeinflusst. Auf Basis der Entdeckung, dass intrazelluläre Expression von PrrC toxisch für S. cerevisiea ist, habe ich mich auf die Mutationsanalyse von E. coli PrrC konzentriert. Ich habe die in vivo Toxizität von PrrC untersucht und herausgefunden, dass PrrC Expression fungizid und nicht fungistatisch ist. Frühere Analysen der Primärstruktur von PrrC haben darauf hingewiesen, dass PrrC zwei funktionelle Domänen enthält. Die ACNase Aktivtät wurde der C terminalen Domäne zu gewiesen. Die N-terminale Domäne PrrCs ist den Nuklotidbindedomänen (NBD)/NTPase-Domänen in Mitgliedern der ABC-Superfamilie homolog. Ich habe geprüft, ob beide Domänen zur Toxizität von PrrC beitragen und ob die NBD tatsächlich funktional mit der ABC-Superfamilie verwandt ist. Getrennte Expression der Domänen ist nicht toxisch und Mutationen in Resten der vorgeschlagenen aktiven Zentren in beiden Domänen beeinflusst PrrC Aktivität in Hefe in vivo. Der dominant-negative Effekt von PrrC Mutanten mit Wildtyp PrrC wies auf eine in vivo Oligomerisierung von PrrC hin. Zusätzlich zu E. coli PrrC habe ich die Toxizität von PrrC Homologen anderer Bakterien getestet um herauszufinden, ob ACNase Aktivität allen Mitgliedern dieser Proteinfamilie eigen ist. Streptococcus mutans PrrC ist sowohl fungizid als auch bakterizid. Überraschenderweise hat Expression von Neisseria meningitides PrrC, trotz ausgeprägter Homologie mit dem E. coli Protein, keinen toxischen Effekt in Hefe oder E. coli. Genauere Untersuchung anhand von Chimären und Punktmutationen führte zur Identifizierung einer R316W Mutation mit toxischer Aktivität. Ich habe die Toxizität dieser Mutante in Hefe in vivo charakterisiert und herausgefunden, dass die Spezifität mit der von E. coli PrrC übereinstimmt. Die Toxizität ist im Vergleich zu E. coli PrrC geringer. Die R316W Mutante von N. meningitides PrrC hat es ermöglicht die Reparatur von PrrC induzierten tRNA-Schäden zu untersuchen. Diese Studien von ACNase Toxizität verdeutlichen, dass S. cerevisiae für Schäden in der tRNA besonders anfällig ist, da die endogene tRNA Ligase Trl1 nicht in der Lage ist derartige Schäden zu beseitigen. Neue Aspekte der tRNA Reparatur haben sich mit der Entdeckung von RtcB in Archaeen, Menschen und Bakterien als RNA-Ligase eröffnet. RtcB füllt eine lange bestehende Lücke im Verständnis des tRNA Splicemechanismus von Archaeen und Metazoen. Die biologische Rolle von bakteriellem RtcB ist nach wie vor unklar. Ich habe gestestet, ob E. coli RtcB als Ligase Trl1 in Hefe ersetzen kann und ob es dem tRNA Schaden durch ACNasen in vivo entgegenwirken kann. Expression von E. coli RtcB komplementiert die lethale TRL1 Deletion in S. cerevisiae und kann vor der Toxizität von PaT in trl1 Zellen schützen.