Boten-RNA-Transfektion in periphere mononukleäre Blutzellen zur Induktion einer Gedächtnis-Immunantwort in vitro

Abstract

In den letzten zwei Jahrzehnten ist die Immuntherapie gegen die verschiedensten Krankheiten zu einem vielversprechenden Forschungsgebiet geworden. Zur Bewertung der Forschungsversuche auf diesem Gebiet werden momentan die spezifischen Lymphozyten in vitro untersucht. Die Effektivität der zu testenden Vakzine wird durch die Art und Stärke der gegen die verwendeten Antigene (anti-Tumor oder virale Krankheiten) ausgelösten zellulären Immunantwort gemessen. Für diese Testsysteme wird eine große Anzahl von autologen Ziel-Zellen die das zu untersuchende Antigen exprimieren benötigt. Für die Auswertung der Vakzinierung mit messenger RNA (mRNA)-Impfstoffen werden dendritische Zellen (DCs), die aus Monozyten gewonnen werden, verwendet. Zur Herstellung von dendritischen Zellen aus Monozyten werden normalerweise mindestens 100 ml Blut vom Patienten benötigt. Die daraus generierte Anzahl an dendritischen Zellen begrenzt die Anzahl an Untersuchungen die durchgeführt werden können. In der vorliegen Arbeit wurde gezeigt, dass periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs, Peripheral blood mononuclear cells) mit mRNA elektroporiert werden können. Diese transfizierten PBMCs können Gedächtnis–T-Zellen in vitro ebenso effizient aktivieren wie mRNA-transfizierte DCs. Es wurden verschiedene Methoden zur mRNA-Transfektion getestet und etabliert. Ebenso wurde ein Testsystem mit diesen transfizierten PBMCs als Ziel-Zellen etabliert, um natürliche oder durch Vakzine ausgelöste Immunantworten in vitro nachzuweisen.

In the last two decades the research in immunotherapies against a wide range of diseases increased very rapidly. To evaluate these immunotherapies currently the lymphocyte´s activity in vitro is measured. The efficacy of the tested vaccines needs to be evaluated by quantification and characterization of the triggered cellular immune response against the used antigens. For these assays a large number of autologous target cells expressing the vaccine antigen are required. For the read-out of messenger RNA (mRNA)-based vaccination studies as target cells mRNA-transfected monocyte-derived Dendritic Cells (Mo-DCs). Their production normally needs at least 100 ml of patients blood. This limits the number of assays that can be performed. We show here that fresh Peripheral Blood Mononuklear Cells (PBMCs) can be transfected with mRNA by electroporation. These transfected PBMCs are as effective as mRNA-transfected MO-DCs in activating memory T-cells in vitro. We tested and established different transfection methods and protocols. We also established an assay system with the transfected PBMCs as target cells for the in vitro monitoring of natural or vaccine-induced immune responses.