From Metabolite Sensing to Protein Regulation by Synechococcus elongatus PCC 7942 PII Protein

Abstract

PII signal transduction proteins have key functions in coordination of central metabolism by integrating signals from carbon, nitrogen and energy status of the cell. They bind the metabolites ATP, ADP and 2-oxoglutarate (2-OG) and control enzymes, transporters and transcription factors involved in nitrogen metabolism. Depending on its effector molecule binding status, PII from Synechococcus elongatus binds a small protein termed PipX, which is a co-activator of the transcription factor NtcA, and regulates the key enzyme of the cyclic ornithine pathway, N-acetyl-L-glutamate kinase (NAGK). This study shows that PII and NAGK from bacteria (S. elongatus) and plants (Arabidopsis thaliana) can functionally complement each other in vitro, demonstrating a strong conservation of this regulatory mechanism through 1.2 billion years of separate evolution. There are two contact interfaces in the PII-NAGK complex from S. elongatus. One of them includes a salt bridge of PII E85 residue with R233 of NAGK. Consequently, E85-PII mutants loose the ability to interact with NAGK. We found PII variants (I86N and I86T) that were able to bind to a NAGK variant (R233A), which was previously shown to be unable to bind wild type PII protein. Based on the crystal structure and biochemical analysis of the I86N PII variant we propose a two-step model for the mechanism of PII-NAGK complex formation. In an initiating step, a contact between R233 of NAGK and E85 of PII initiates the bending of the extended T-loop of PII, followed by a second step, where a bended T-loop deeply inserts into the NAGK clefts to form the tight complex. The 2-OG is a key molecule in PII-mediated signal transduction. Crystal structures of S. elongatus wild type PII identified the site of 2-OG binding located in the vicinity of the ATP-binding site between the subunit clefts. The site is formed by the ATP-ligated Mg2+ ion and PII residues of the T-loop itself, which adopts a unique bend conformation. The structures of PII trimers with one or two bound 2-OG molecules explain the anticooperativity of the effector binding sites and demonstrate the inter-subunit communication inside the trimer. PII binds ATP and 2-OG in a synergistic manner, with the ATP-binding sites also accepting ADP. Different ADP/ATP ratios strongly affected the properties of PII signalling including 2-OG binding and interactions with its target proteins. ADP modulates PII signalling to the receptor NAGK primarily at low 2-OG levels and antagonises the inhibitory effect of 2-OG for PII-PipX interaction. Apparently PII has a fine-tuned mechanism of sensing both changing energy charge and carbon/nitrogen balance at the same time.

PII Signalproteine spielen eine Schlüsselrole in der Regulation des zellulären Zentralmetabolismus in Bezug auf den Kohlenstoff-, Stickstoff- und Energiestatus der Zelle. Sie binden die Metabolite ATP, ADP und 2-OG (2-Oxoglutarat) und kontrollieren Enzyme, Transporter und Transkriptionsfaktoren, die an Stickstoffmetabolismus beteiligt sind. Abhängig von dem gebundenen Effektormolekül, interagiert PII aus Synechococcus elongatus mit PipX, einen co-Aktivator des Transkriptionsfaktors NtcA, und reguliert das Schlüsselenzym des zyklischen Ornitinwegs, N-Acetyl-L-Glutamatkinase (NAGK). Im Komplex interagieren PII und NAGK unter anderen über eine Salzbrücke zwischen E85 von PII und R233 von NAGK. PII Varianten, die eine Mutation an der Aminosäure 85 haben, verlieren die Fähigkeit mit NAGK zu interagieren. Wir haben zwei PII-Varianten entdeckt, die die NAGK-Variante R233A binden können, obwohl dieses Enzym mit Wildtyp PII nicht interagiert. Aufgrund der Kristallstruktur und biochemischen Analysen von I86N PII, haben wir einen zweistufigen Mechanismus der PII-NAGK-Komplexbildung vorgeschlagen. Außerdem haben wir gezeigt, dass PII und NAGK aus Bakterien (S. elongatus) und Pflanzen (Arabidopsis thaliana) sich gegenseitig in vitro funktionell ersetzen können, was die starke Konservierung von PII-Signaltransduktion demonstriert. 2-Oxoglutarat ist ein zentrales Molekül in der PII-vermittelten Signaltransduktion. Kristallstrukturen von S. elongatus Wildtyp PII haben die 2-OG-Bindungsstelle in der Nähe von der Nukleotidbindungsstelle identifiziert. Die 2-OG-Bindungsstelle wird vom ATP-gebundenen Mg2+-Ion und vom PII-T-loop gebildet. Dabei nimmt dieser Loop eine vorher nicht bekannte Konformation ein. PII-Strukturen mit einem, zwei und drei gebundenen 2-OG Molekülen klären den Mechanismus der antikooperativen Ligandenbindung an PII auf. ATP-Bindungstellen am PII-Protein können auch von ADP besetzt werden. Verschiedene ATP/ADP-Verhältnisse beeinflussen die Signaltransduktioneigenschaften des PII-Proteins. ADP verhindert 2-OG-Bindung an PII und behebt den negativen Effekt von 2-OG auf die PII-PipX-Interaktion. Die PII-Regulation der NAG-Kinase wird durch ADP vor allen bei niedrigen 2-OG-Konzentrationen moduliert. Offensichtlich, spricht PII auf feinste Änderungen bezüglich des Energie- und Kohlenstoff/Stickstoff-Status der Zelle an und verändert entsprechend seine Eigenschaften als Signaltransduktionprotein.