Funktionelle Charakterisierung von Zellwandproteinen in der Zelldifferenzierung von Heterozysten bildenden Cyanobakterien der Ordnung Nostocales

Abstract

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Zellwand-Amidasen AmiC1(Ana) und AmiC2(Ana) eine unterschiedliche Relevanz für das diazotrophe Wachstum bei Anabaena sp. PCC 7120 besitzen. Während die Inaktivierung von amiC2(Ana) keine Auswirkungen auf die Differenzierung von Heterocysten hatte, führte die Mutation in amiC1(Ana) zum stark eingeschränkten Differenzierungspotential. Dabei war der gesamte Prozess der Heterocystendifferenzierung bereits in einem sehr zeitigen Stadium beeinträchtigt. Die amiC1(Ana)-Mutante zeigte zum Einen keinen Abbau der Phycobiliproteine. TEM-Studien bestätigten zudem, dass in SR477 keine Umbildung der intrazellulären Thylakoid-Membran stattfand. Darüber hinaus wurde durch die Inaktivierung von amiC1(Ana) der Aufbau der Heterocysten-spezifischen Zellwandhülle verhindert, so dass weder die Auflagerung von Hep auf die Zellwand noch die Synthese der Hgl stattfanden. Durch semi-quantitative RT-Analysen konnte demonstriert werden, dass die Ursache des Differenzierungsdefizits nicht in einer gestörten Aktivierung der Heterocysten-spezifischen Regulatoren beruht. Vielmehr zeigten FRAP-Untersuchungen, dass in SR477 der unspezifische Transfer niedermolekularer Stoffe über direkte Zell-Zell-Verbindungen stark beeinträchtigt war. Dies verdeutlicht die große Bedeutung der Zell-Zell-Kommunikation für die Initiation der Heterocystendifferenzierung. Obwohl die Aktivität der Zellwand-Amidasen AmiC1Ana und AmiC2Ana nicht für das vegetative Wachstum auf gebundenen Stickstoffquellen benötigt wird, hatte die Inaktivierung der Amdiasen Auswirkungen auf die natürliche Integrität der äußeren Membran. Durch Lokalisationsstudien von AmiC2 von N. punctiforme und von AmiC1(Ana) und AmiC2(Ana) von Anabaena sp. PCC 7120 die mittels Gfp-Fusionen durchgeführt wurden, konnte die Hypothese bekräftigt werden, dass die Zellwand-Amidasen eine spezifische Funktion bei Modifikation des Peptidoglykan am Septum junger Tochterzellen einnehmen. Die Lokalisation von Zellwand-Amidasen in Proheterocysten lässt zusätzlich auf eine Funktion der Amidasen beim Peptidoglykan-Abbau zur Bildung des Halskanals vermuten. Die Lokalisation von AmiC2 von N. punctiforme an der Spitze der endständigen Zelle der Hormogonien deutet darauf hin, dass AmiC2 noch zur vollständigen Abschnürung des Septums während der Zellteilung, wie sie beispielsweise in E. coli auftritt, befähigt ist. Dies verdeutlicht auch die starke Kontrolle der Zellwand-Amidasen im vegetativen Wachstum. Bei der Untersuchung der subzellulären Lokalisation von SepJ in N. punctiforme konnte demonstriert werden, dass SepJ, der postulierten Funktion als Kanal für Zell-Zell-Kommunikation entsprechend, in den Septen der Einzel-Zellen im vegetativen Filamenten als auch im Hormogonien-Filament akkumuliert. Während der Reifung von vollständig ausgebildeten Akineten verschwindet SepJ. Dieses Ergebnis entspricht der Funktion der Akineten als einzelliges Überdauerungsstadium, die keine Kommunikation mit dem Filament benötigen.

Cyanobacteria of the order Nostocales are defined by an unbranched filamentous morphology and the ability to react to environmental changes by formation of differentiated cells. For example, in response to nitrogen starvation Anabaena sp. PCC 7120 and Nostoc punctiforme form specialized cells for nitrogen fixation, called heterocysts. Heterocysts supply the filament with fixed nitrogen and in return achieve fixed carbon from the neighboring vegetative cells. Therefore Anabaena and N. punctiforme represent true multicellular organisms, in which interdependent cells with specialized function exchange metabolites and signaling molecules. To provide a micro-oxic environment for the oxygen-sensitive nitrogenase, heterocysts form a special cell envelope on top of the preexisting gram negative cell wall. Furthermore structures for cell-cell communication are needed. It can be assumed that a plenty of proteins are involved in remodeling and reorganization of the cell wall. One of these cell wall related proteins is N-acetylmuramyl-L-alanin-amidase (AmiC), which hydrolyzes the peptidoglycan. Recently we have shown that a knockout of the amidase gene amiC2 in N. punctiforme leads to a complete loss of differentiation capability and filament dystrophy. To investigate the similarities and differences in function of AmiC proteins in filamentous cyanobacteria, we characterized amiC1 and amiC2 mutants in Anabaena sp 7120. The mutant with a knockout in the amiC1 homolog alr0092 has lost the ability of heterocyst differentiation. Hence mutants were not able to grow on N2 as sole nitrogen source. However, in contrast to N. punctiforme, the amiC2 Mutant alr0093 can still grow on N2 and does not show an aberrant phenotype. Furthermore we made GFP-fusion to localize the AmiC– proteins in the cell wall by fluorescence microscopy.