Analyzing biological activity of drugs- Inter- and intracellular signaling analysis within an organotypic co-culture system

Abstract

The human immune system comprises a highly complex network of immunoregulatory signals, which not only involves cells of the immune system but also cells of the surrounding tissues and organs. This inherent complexity together with a distinct diversity among different individuals exacerbates the problems of developing appropriate in vitro test systems. Cell lines are the workhorses in the preclinical phase of the drug development process. However since they originate from degenerated cells they can only partially mimic the in vivo situation. In contrast animal models allow drug testing in a multi-cellular environment with the limitation that they also differ considerably from the human body. In practice the most often used cellular test systems for the evaluation of drug effects on the immune system are PBMC preparations or test systems using whole blood. However since not all cells contributing to immune reactions are represented in these models the development of more elaborate organotypic co-culture systems represents a closer approximation to the in vivo conditions in the human body. Embedded in the BMBF funded project HuCoCSys, the goal of this thesis was the detailed characterization and validation of an established organotypic co-culture model of the human gut. Consisting of differentiated Caco-2 gut epithelial cells and human whole blood this in vitro model facilitates the testing of orally applied drugs or drug candidates in an in vivo-like environment. In initial experiments the effect of the proinflammatory mediators IL-1beta, TNFalpha and IFNgamma on the epithelial barrier, was studied using TEER measurements and immunohistochemistry. It was shown that treatment with proinflammatory mediators leads to an increase in epithelial permeability and that this is accompanied by changes in the subcellular localization of cell junction proteins. It was demonstrated that Caco-2 cells are capable of secreting the chemokines IL-8, MCP-1 and IP-10 upon treatment with IL-1beta/TNFalpha and IFNgamma. These results indicate that Caco-2 cells can be set to an “inflamed state” in order to mimic the altered barrier function found during inflamed conditions of the gut. In additional experiments the effects of such a proinflammatory treatment on intracellular Receptor Tyrosine Kinase associated signaling was investigated using multiplexed sandwich immunoassays. It was found that treatment of the Caco-2 cells with IL-1beta leads to a time dependent increase in the phosphorylation of EGFR at Serine 1047. By using a library of protein kinase inhibitors and database mining p38alpha and IKK2 could be identified as potential S1047 targeting kinases. In the context of this thesis three multiplexed sandwich immunoassay panels were developed on the Luminex platform and optimized for the quantification of cytokines and chemokines in human plasma. These assays were applied for the quantification of immune mediators in multiple plasma samples derived from co-culture experiments. Various test substances were added to the top side of Caco-2 epithelial monolayer in different concentrations and their immunomodulatory properties subsequently analyzed in whole blood upon stimulation with immune activating agents. By using blood of different donors the individual variability of the immune response was incorporated in the overall analysis. The application of the multi-parameter readout system to this highly sophisticated co-culture model of the human gut enabled the detailed analysis of the immunomodulatory properties of well characterized antophlogistic drugs as well as those or uncharacterized natural products. The comparison of dose response curves obtained for five well characterized drugs Dexamethasone, Prednisolone, Ibuprofene and Tacrolimus with those of the uncharacterized substances allowed to draw conclusions on potential modes of action. This was shown for Dihydroxyguajaretic Acid. In contrast to our expectations, pretreatment of the epithelial monolayer with IL-1beta/TNFalpha ahead of drug application did not significantly alter the dose dependent effects of the tested substances in the coculture experiments. Although the Caco-2 monolayers showed an increase epithelial permeability and an altered cell adhesion protein localization the observed impact on drug efficacy was low. In summary this study showed that the presented co-culture system can be used to evaluate the effects of drugs and drug candidates after passage of the intestinal barrier in a highly standardized in vivo like situation. This model has the potential to deliver a more detailed preclinical characterization of desired and undesired drug effects. The large data set generated in the course of this study will provide the basis for the future analysis of the immunomodulary effects of drug candidates.

Das menschliche Immunsystem stellt ein komplexes Netzwerk aus einer Vielzahl verschiedener Zellen und regulatorischen Signalen dar. Neben den Immunzellen sind auch Zellen benachbarter Gewebe an regulatorischen Prozessen beteiligt. Diese inhärente Komplexität erschwert die Entwicklung von in vitro Testsystemen die in der Lage sind diese Komplexität mit hinreichender Genauigkeit abzubilden. Immortalisierte Zellinien und Tiermodelle werden routinemäßig in der präklinischen Phase der Medikamentenentwicklung eingesetzt. Beide Systeme weisen jedoch deutliche Unterschiede zu den in vivo Verhältnissen im menschlichen Körper auf. Das in der Praxis am häufigsten eingesetzte System für die Untersuchung der Wirkung von Medikamenten auf das Immunsystem stellen PBMC Präparationen und Vollblut-Kulturen dar. In diesen Systemen sind jedoch nicht alle an der Immunreaktion beteiligten Zelltypen repräsentiert. In diesem Zusammenhang stellt die Entwicklung komplexer organotypischer Co-Kultursysteme eine weitere Näherung an die in vivo Verhältnisse dar. Diese Dissertation entstand im Rahmen des BMBF geförderten Verbundprojekts HuCoCSys. Ziel war die detailierte Charakterisierung und Validierung eines bereits etablierten organotypischen Co-Kulturmodels des menschlichen Darmes. Die Co-Kultivierung von Caco-2 Kolonkarzinomzellen als Model des menschlichen Dünndarmepithels und Vollblut von verschiedenen Spendern sollte dabei die Untersuchung der Wirkung oral applizierter Medikamente auf das Immunsystem ermöglichen. In einleitenden Experimenten wurde der Effekt der proinflammatorischen Zytokine IL-1beta , TNFalpha und IFNgamma auf die Integrität der epithelialen Barriere mittels TEER Messungen und immunohistochemischen Analysen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden daß die Behandlung der Caco-2 Zellen mit proinflammatorischen Zytokinen zu einer erhöhten Permeabilität des Epithels sowie zu einer geänderten Lokalisation von Zelladhäsionsproteinen führt. Weiterhin konnte gezeigt werden, das die Caco-2 Zellen in der Lage sind auf die Behandlung mit IL-1beta/TNFalpha sowie IFNgamma mit der Ausschüttung der Chemokine IL-8, MCP-1 und IP-10 zu reagieren. Diese Ergebnisse zeigen, daß Caco-2 Zellen in einen „entzündlich veränderten“ Zustand versetzt werden können um die veränderten Eigenschaften der intestinalen Barriere unter entzündlichen Bedingungen in vitro nachzubilden. In weiteren Experimenten wurde die Wirkung proinflammatorischer Zytokine auf intrazelluläre Rezeptor-Tyrosin Kinase vermittelte Signalwege untersucht. Hierfür wurden multiplexe Sandwich Immunoassays eingesetzt. Dabei konnte beobachted werden, daß die Behandlung von ausdifferentieren Caco-2 Zellen mit IL-1beta zu einer zeitabhängigen Phosphorylierung des EGF-Rezeptors an Serin 1047 führt. Über die Verwendung einer Kinase Inhibitor Library und einer anschließenden Literaturdatenbank Recherche konnten p38alpha und IKK2 als potentielle Serin1047 phosphorylierende Kinasen identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei unterschiedliche Luminex basierte Sandwich Immunoassay Panel entwickelt und für die Quantifizierung von Immunmediatoren in humanem Vollblut optimiert. Diese Assays wurden für die quantitative Analyse von Immunmediatoren in einer Vielzahl humaner Plasmaproben aus Co-Kulturexperimenten verwendet. Dabei wurden in der Co-Kultur unterschiedliche Konzentrationen der Testsubstanzen auf differenzierte Caco-2 Monolayer gegeben und deren Wirkung in zuvor stimuliertem Vollblut mittels multiplexen Sandwich Immunoassays untersucht. Durch die Verwendung von Blut unterschiedlicher Spender konnte die Individualität des Immunsystems in die Analyse integriert werden. Die Kombination eines komplexen Co-Kultursystems mit der multiplexen Analyse von Immunmediatoren ermöglichte dabei die detailierte Beschreibung der immunmodulierenden Effekte verschiedener Antiphlogistika und noch uncharakterisierter Naturstoffe. Der Vergleich der Dosis-Wirkungskurven von Dexamethason, Prednisolon, Ibuprofen, Diclofenac und Tacrolimus mit Dihydroxyguajaretsäure ermöglichte es dabei Rückschlüsse of potentielle Wirkmechanismen zu ziehen. Entgegen unserer Erwartungen ergaben sich durch die Behandlung der Caco-2 Zellen mit IL-1beta und TNFalpha vor Medikamentenaplikation keine signifikant veränderten Dosis-Wirkungskurven obwohl in den vorrangegangenen Experimenten eine erhöhte Durchlässigkeit des Epithels sowie eine veränderte Lokalisation von Zelladhäsionsproteinen nachgewiesen werden konnte. Daß im Rahmen dieser Studie eingesetzte in vitro Model des menschlichen Darmes ermöglichte die standardisierte Untersuchung der Wirkung oral applizierter Medikamente und Medikamentenkandidaten unter in vivo ähnlichen Verhältnissen. Das beschrieben Model stellt eine interessante Ergänzung zu den routinemäßig in der präklinischen Phase eingesetzten PBMC Präparationen, Vollblutassays und Tiermodellen dar. Die im Rahmen dieser Studie generierten Datensätze bilden die Basis für die zukünftige Analyse der immunmodulatorischen Effekte weiterer Wirkstoffe.