Investigations on the Biosynthesis of the Central Pyrrole Moiety of Coumermycin A1 and Identification of new Caprazamycins by LC/ESI-MS/MS

Abstract

In the first part of the thesis the production of novobiocin, an aminocoumarin antibiotic, was investigated in 24-square deepwell plates, an alternative cultivation system to Erlenmeyer flasks. Comparison of novobiocin production in Erlenmeyer flasks and 24-square deepwell plates showed that the production was originally higher in the Erlenmeyer flasks (24 mg/L vs. 11 mg/L). However, the variability was much lower in the deepwell plate (SD 6% vs. 39%). Optimization of the inoculation ratio and preparation of frozen inoculum from a defined section of the growth phase further reduced the variability, especially between independent cultivation batches (SD 6% vs. 52%). Addition of the water soluble siloxylated ethylene oxide/propylene oxide copolymer Q2-5247, as artificial oxygen carrier, as well as the overexpression of the pathway-specific positive regulator NovG increased novobiocin production to levels comparable to those in the Erlenmeyer flasks (54 mg/L and 48 mg/L, respectively). Combination of the positive effects of NovG and of copolymer Q2-5247 led to a novobiocin production of 163 mg/L, exceeding all previous production levels observed in Erlenmeyer flasks in our laboratory.

Coumermycin A1, another aminocoumarin antibiotic, contains two types of pyrrole moieties, two terminal 5-methylpyrrole-2-carboxylic acid moieties and the central 3-methylpyrrole-2,4-dicarboxylic acid moiety. The terminal pyrrole moiety is also present in clorobiocin and its biosynthesis from L-proline by action of CouN1-7 is well investigated. However, the biosynthetic precursors of the central pyrrole moiety have remained unknown, and none of the genes or enzymes involved in its formation have been identified so far. In the second part of this thesis evidence is provided that five genes, termed couR1-couR4, contained in a contiguous 4.7 kb region within the coumermycin biosynthetic gene cluster, are required for the biosynthesis of the central pyrrole moiety. Each of these genes was deleted individually, resulting in a strong reduction (by at least 92%) or an abolishment of coumermycin production. External feeding of the central pyrrole moiety, i.e. 3-methylpyrrole-2,4-dicarboxylic acid, restored coumermycin production. One of the enzymes involved, i.e. CouR3, shows similarity to the L-threonine kinase PduX from Salmonella enterica, and feeding of O-phospho-L-threonine to a couR3 defective mutant resulted in a moderate increase of coumermycin production, while feeding of L-threonine (0.197 mg/L vs. 0.143 mg/L) did not, indicating that the first step in the biosynthesis might be the phosphorylation of L-threonine. Feeding of [U-13C,15N]L-threonine and 13C NMR analysis of the resulting labeled CPM monoamide unequivocally proved that threonine is incorporated intact into the central pyrrole moiety (19 % enrichment), providing the heterocyclic nitrogen as well as four of the seven carbons of this moiety. Therefore, the central pyrrole moiety is formed via a new, hitherto unknown biosynthetic pathway. A hypothesis for the reaction sequence leading to this moiety, starting from L-threonine and oxaloacetate, is presented.

Caprazamycins are potent anti-mycobacterial liponucleoside antibiotics that belong to the translocase I inhibitors and are produced by Streptomyces sp. MK730-62F2. In the third part of the presented thesis, a liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC/ESI-MS/MS) method is reported for the structural elucidation of caprazamycins and liposidomycins from culture extracts of the respective producer strains. Both caprazamycins and liposidomycins were readily detected in positive as well as in negative ionization mode and the comparison of the fragmentation pattern revealed several characteristic product ions. These product ions can be divided into two groups, according to whether they still contain the fatty acid side chain or not. Those that lack the fatty acid side chain are characteristic for all caprazamycins and/or liposidomycins, respectively, and were used for the identification of six new caprazamycins that probably contain unsaturated fatty acid side chains. The proposed chemical formula of these new compounds fit that of the fatty acid moieties of the liposidomycins Y, Z, A, G, K and N, respectively. Furthermore, a chromatographic method using a boronic acid stationary phase, which was originally used for the purification of modified nucleosides from cell cultures, was adapted for the partial purification of the culture extracts.

Im ersten Teil der Arbeit wurde die Produktion des Aminocoumarin-Antibiotikums Novobiocin in 24-Kammer-Platten untersucht, welche ein alternatives Kultivierungssystem zu Erlenmeyerkolben darstellen. Ein Vergleich der Novobiocinproduktion in Erlenmeyerkolben und einer 24-Kammer-Platte ergab zunächst eine deutlich höhere Produktion im Erlenmeyerkolben (24 mg/L vs. 11 mg/L). Die Kulturen aus der 24-Kammer-Platte wiesen im Vergleich zu denen aus dem Erlenmeyerkolben allerdings deutlich geringere Produktionsschwankungen auf (Standardabweichung: 6% vs. 39%). Durch die Optimierung des Animpfverhältnisses sowie die Herstellung von eingefrorenem Inoculum aus Vorkulturen in der Wachstumsphase, konnte eine weiteren Abnahme der Variabilität, besonders zwischen unabhängige Kultivierungen (Standardabweichung: 6% vs. 52%), erreicht werden. Der Zusatz eines wasserlöslichen Copolymers aus Ethylenoxid und Propylenoxid sowie die Überexpression des spezifischen positiven Regulators NovG führte jeweils zu vergleichbaren Produktionen wie im Erlenmeyerkolben (54 mg/L bzw. 48 mg/L). Diese positiven Effekte von Copolymer-Zusatz und NovG-Überexpression lassen sich auch kombinieren, sodass schließlich eine Novobiocinproduktion von 163 mg/L erreicht werden konnte, was alle bisher von uns beobachteten Produktionsraten im Erlenmeyerkolben deutlich übersteigt.

Coumermycin A1, ein weiteres Aminocoumarin-Antibiotikum, enthält zwei verschiedene Pyrroleinheiten, die beiden endständigen 5-Methylpyrrol-2-carbonsäure-Einheiten und die zentrale 3-Methylpyrrol-2,4-di-carbonsäure. Die endständige Pyrroleinheit findet sich auch im Clorobiocin wieder und ihre Biosynthese, ausgehend von L-Prolin und katalysiert durch CouN1-7, ist gut untersucht. Die Biosynthesevorstufen der zentralen Pyrroleinheit, andererseits, sind noch vollkommen unbekannt und keines der beteiligten Gene oder Enzyme wurden bisher identifiziert. Der zweite Teil dieser Arbeit erbringt nun den Nachweis, dass fünf Gene, couR1-couR4, die sich in einem 4,7 kb großen Abschnitt innerhalb des Coumermycin-Genclusters befinden, für die Biosynthese der zentralen Pyrroleinheit verantwortlich sind. Jedes dieser Gene wurde einzeln inaktiviert, was zu einer starken Reduzierung (wenigstens 92%) oder sogar zum Ausfall der Coumermycin-produktion führte. Durch Fütterung der zentralen Pyrroleinheit, 3-Methylpyrrol-2,4-dicarbonsäure, konnte die Produktion dann teilweise wiederhergestellt werden. Eines der beteiligten Enzyme, und zwar CouR3, zeigt Ähnlichkeit zu der Threoninkinase PduX aus Salmonella enterica und die Fütterung von O-Phospho-L-Threonin zu einer couR3-defekten Mutante führte zu einer leichten Produktionssteigerung im Vergleich zur Fütterung von L-Threonin (0,197 mg/L vs. 0,143 mg/L). Dies deutet darauf hin, dass der erste Schritt in der Biosynthese der zentralen Pyrroleinheit womöglich in der Phosphorylierung von L-Threonin besteht. Die Fütterung von [U-13C,15N]L-Threonin und die anschließende 13C NMR-Analyse des resultierenden gelabelten Monoamids der zentralen Pyrroleinheit zeigen eindeutig, dass das intakte Threonin in diese Einheit eingebaut wird (Anreicherung 19%) und dass es sowohl den heterozyklischen Stickstoff als auch vier der sieben Kohlenstoffatome liefert. Das bedeutet, dass die zentrale Pyrroleinheit von Coumermycin A1 über einen neuen, bisher vollkommen unbekannten, Biosyntheseweg gebildet wird. Eine Hypothese für den Ablauf dieser Biosynthese, ausgehend von Threonin und Oxalacetat, wurde aufgestellt.

Caprazamycine sind Liponukleosid-Antibiotika und werden zu den Translokase I-Inhibitoren gezählt. Sie werden von Streptomyces sp. MK730-62F2 produziert und weisen eine sehr gute Wirksamkeit gegen Mykobakterien und anderen grampositive Mikroorganismen auf. Im dritten Teil dieser Arbeit wird eine HPLC/ESI-MS/MS-Methode für die Identifizierung von Caprazamycinen und Liposidomycinen, in Kulturextrakten der jeweiligen Produktionsstämme, vorgestellt. Beide Verbindungsklassen konnten sowohl bei positiver als auch bei negativer Ionisierung eindeutig identifiziert werden und der Vergleich der Fragmentierungsmuster zeigte mehrer charakteristische Produktionen. Diese lassen sich in zwei Klassen einteilen, je nachdem ob sie noch die Fettsäure-Seitenkette enthalten oder nicht. Produktionen denen die Fettsäure fehlt, sind charakteristisch für alle Caprazamycine bzw. Liposidomycine, und wurden daher für die Identifizierung von insgesamt sechs neuen Caprazamycinen herangezogen, welche wahrscheinlich ein- und zweifach ungesättigte Fettsäuren enthalten. Die vorgeschlagenen Summenformeln der neuen Verbindungen passen jeweils zu den Fettsäuren der Liposidomycine Y, Z, A, G, K und N. Außerdem wurde eine chromatographische Methode unter Verwendung eines Boronsäure-Gels, welche ursprünglich für die Aufreinigung von modifizierten Nukleosiden aus Zellkulturen verwendet wurde, für die teilweise Aufreinigung der Kulturextrakte angepasst.