Etablierung, Optimierung und Anwendung verschiedener Modelle zur Charakterisierung von p38 MAPK Inhibitoren

Abstract

Inhibitoren der p38alpha MAP Kinase gelten als vielversprechende Wirkstoffkandidaten für die Behandlung von chronischen Entzündungskrankheiten, wie der Rheumatoiden Arthritis oder entzündlichen Darmerkrankungen. In präklinischen Untersuchungen zeigten Kandidaten anti-entzündliche Effekte, indem sie die Ausschüttung von Entzündungsmediatoren, wie TNF-alpha hemmten. Klinische Studien im Menschen hingegen resultierten wiederholt in mangelnder Wirksamkeit und toxischen Nebenwirkungen. Das Ziel der Arbeit war verschiedene in vitro Testverfahren zu entwickeln, die das Potenzial von neuen p38 MAPK Inhibitoren in biologischem Gewebe systematisch einstufen. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein p38 MAPK Aktivitätsassay modifiziert, um die Hemmwirkung der Inhibitoren auf p38alpha möglichst schnell zu bestimmen. Durch die Optimierung blieb die bisherige Qualität des Versuchs erhalten und zusätzlich wurden deutliche Zeit- und Kosteneinsparungen erreicht. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Testmodell entwickelt, das mit Vollblut von Ratte, Schwein und Mensch, sowie mit Milzzellen der Maus durchgeführt werden kann. Mit Hilfe des Modells wurden für p38 MAPK Inhibitoren deutliche Speziesunterschiede herausgearbeitet. Die Inhibitoren zeigten in Nagern, mit denen die meisten Krankheitsmodelle durchgeführt werden, eine schlechtere Wirkung als in Mensch oder Schwein. Basierend auf den Ergebnissen ist eine Übertragung von Tierexperimentdaten auf den Menschen als problematisch anzusehen. Der Schwerpunkt der Arbeit lag in der Entwicklung eines Testsystems mit PBMCs, mit dem gleichzeitig die Wirkung von p38 MAPK Inhibitoren auf Zielgene der Protein- und RNA Ebene, sowie die Aktivierung verschiedener p38 MAPK Isoformen (p38alpha, p38beta, p38gamma, p38delta) untersucht werden kann. Nach der Etablierung wurde die Untersuchung auf Blut- und Darmproben von Spendern mit der entzündlichen Darmerkrankung Morbus Crohn ausgedehnt. In Blutzellen von Morbus Crohn Patienten zeigten die p38 MAPK Inhibitoren eine hohe interindividuelle Hemmwirkung auf die Ausschüttung des Zytokins IL-6, einem charakteristischen Entzündungsmarker von Morbus Crohn. Weiter konnte nachgewiesen werden, dass in PBMCS vor allem p38alpha phosphoryliert wird, in entzündetem Darmgewebe aber p38delta; am stärksten aktiviert wird. Denkbar ist, dass p38delta eine wichtige Rolle im Entzündungsgeschehen von Morbus Crohn spielt, was bisher nicht bekannt war. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass für die Indikation Morbus Crohn die gängigen p38alpha/p38beta Inhibitoren möglicherweise ungeeignet sind, p38delta allerdings ein potenzielles Drug Target in Morbus Crohn darstellt.

Inhibition of the p38alpha mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) is promising for the treatment of inflammatory disorders, primarily through the inhibition of the expression of inflammatory mediators, like TNFalpha. While preclinical data attest p38 MAPK inhibitors high anti-inflammatory potential, the efficacy of candidates in clinical trials is limited so far. The aim of this work was to develop different in vitro test systems to systematically evaluate novel p38 MAPK inhibitors in a series of different biological tissues. First, a sophisticated p38 MAPK activity assay was optimized in terms of speed to measure the inhibitory effect of compounds on p38alpha more quickly. In summary, the quality and sensitivity of the assay were sustained, with additional saving of cost and time. Based on these findings the development of a test system, using whole blood and primary cells from different species, is presented in the following part. Characterization of different p38 MAPK inhibitors in rat, pig, mouse and humans resulted in significant interspecies differences for dose sensitivity. IC50 values from human whole blood and PBMCs showed higher sensitivity towards p38 MAPK inhibition compared with data from pig or rat. These observations indicate that animal models appear to be limited for valid prediction of the inhibitory potential in humans. The main part of the work was to investigate p38 MAPK inhibition on the RNA and protein level of marker genes and different p38 MAPK isoforms (p38alpha, p38beta, p38gamma, p38delta). After assay establishment PBMCs and colon biopsies from patients with Crohn’s Disease, an inflammatory bowel disease, were analyzed. The inhibitory effect of the tested compound on IL-6 release, an inflammation marker in Crohn’s Disease, was highly variable between individuals. In addition, while p38alpha was active in PBMCs high levels of phosphorylated p38delta were detected in inflamed colonic tissue. Consequently, beside p38alpha also p38delta seems to play a significant role in Crohn’s Disease. In summary, this work suggests that p38alpha/p38beta MAPK inhibitors may be not suitable for the treatment of Crohn’s Disease. However, a role for p38delta in Crohn’s Disease was successfully identified indicating a promising therapeutic target for further drug development.