Untersuchungen zur Herstellung von biofunktionalisierten Implantaten für humane Kieferperiostzellen

Abstract

Gezielter Kieferknochenaufbau (Kieferknochenaugmentation) findet bei Lippen-, Kiefer- und Gaumenspalten, nach Tumorresektionen, Kieferatrophien und Knochenzysten seine Anwendung. Der Goldstandard ist bisher immer noch die Verwendung von autologem Knochenmaterial, was jedoch zwangsläufig zu Schwierigkeiten an der Entnahmestelle (Donormorbidität) bezüglich der Menge des entnommenen Materials, des Infektionsrisikos und der Schwächung des Knochens an dieser Stelle führt. Dieses Problem soll durch Tissue Engineering-Ansätze, die einerseits die Verwendung von autologen Stammzellen und andererseits von geeigneten Trägermatrizen beinhalten, umgangen werden. Ziel dieser Studie war es, ein biofunktionalisiertes Implantat, besiedelt mit humanen Kieferperiostzellen (JPCs) zu generieren, das die Adhäsions-, Proliferations- und Differenzierungskapazität der JPCs verstärkt. Dies sollte anhand zwei verschiedener Verfahren realisiert werden. Die erste Variante beinhaltete die Funktionalisierung von Polylaktid-Trägermatrizen mit verschiedenen RGD Peptiden (Peptide zusammengesetzt aus drei Aminosäuren: Arginin-Glycin-Asparaginsäure, abgekürzt mit RGD) anhand verschiedener Beschichtungsvarianten. Die erzielten Ergebnisse zeigten, dass die Beschichtung mit zyklischen Peptiden auf 3D Ebene ein schwaches Adhäsions- und Proliferationsverhalten der JPCs zur Folge hatte, im Gegensatz zu den dicht besiedelten, indirekt beschichteten Konstrukten mit Poly-L-Lysin als Platzhalter (Spacer) für die Zellen. Durch Genexpressionsanalysen sowie elektronenmikro-skopische Aufnahmen und Elementanalysen konnte ebenfalls belegt werden, dass die osteogene Differenzierbarkeit der JPCs innerhalb der indirekt beschichteten Polylaktid-Matrizen am stärksten ausgeprägt war. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die in der vorliegenden Arbeit entwickelte RGD Biofunktio-nalisierunsmethode sich optimal für die Verstärkung der Zellparameter wie Adhäsion und Proliferation der JPCs eignete. Ein zweiter Ansatz zur Oberflächenbeschichtungen von Tissue Engineering-Konstrukten war die Generierung eines Oligonukleotids (Aptamer), das hochaffin an humane Kieferperiostzellen binden und eine Progenitor-Subpopulation aus dem Gesamtzellverband anreichern konnte. Über einen in vitro Selektionsprozess (SELEX) wurde aus einem Startpool von ca. 1015 80 bp langen Oligonukleotidsequenzen erstmals ein Aptamer generiert, das vermehrt an osteogen-nicht jedoch an adipogen- und chondrogen andifferenzierte Zellen binden konnte, und auch nur mit geringerer Affinität an nicht induzierte JPCs bzw. andere getestete Zelltypen. Die Bindungsaffinität war donorabhängig und hing nicht vom in vitro Kalzifizierungspotential der Patienten ab. Allerdings konnte belegt werden, dass mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark und der Plazenta im osteogen andifferenzieren Zustand ebenso an das Aptamer binden konnten. Bei der Untersuchung des Mineralisierungspotentials der Aptamer-positiven im Vergleich zur Aptamer-negativen Fraktion konnten keine signifikanten Unterschiede der beiden Fraktionen festgestellt werden. Der Biofunktionalisierungsansatz anhand der Aptamere stellte eine völlig neuartige Methode im Tissue Engineering Bereich dar und zeigt Potential zur Weiterentwicklung. Nach den bisher durchgeführten Analysen scheint das Aptamer 74 bisher noch keine besonderen Vorteile gegenüber der Methode der RGD-Peptidbeschichtung zu haben. Als Schlussfolgerung dieser Studien kann fest-gehalten werden, dass die indirekte RGD-Beschichtung über Poly-L-Lysin eine für das Knochen Tissue Engineering äußerst geeignete Methode darstellt. Im nächsten Schritt der in vivo Analyse muss dieses Verfahren seine klinische Relevanz unter Beweis stellen.

The applications of jaw bone augmentations are cleft lip and palates, bone cysts, bone defects after tumor resections and bone atrophies and the regeneration strategies in these regions gain more and more importance nowadays. The gold standard still remains the use of autologous bone, which automatically leads to considerable donor morbidities at the donor site. Using tissue engineering, a lot of efforts were done to overcome these problems by analyzing different scaffolding materials, cell sources and enhancing factors (growth factors, angiogenesis factors). The aim of this study was to generate a biofunctionalized implant, which is able to enhance JPC adhesion, proliferation and differentiation into osteogenic tissue. This was realized by two different approaches. For the first approach, constructs were coated with different RGD peptides and different coating variants. We obtained poor adhesion and proliferation rates of cells growing on cyclic peptide coated scaffolds. Best results for cell adhesion and proliferation were achieved by indirect coating via PLL. Gene expression analyses, electron microscopy and EDX spectroscopy revealed, that cells growing within indirect coated constructs were able to mineralize in vitro and showed the highest level of mineralization. The obtained results indicated that this method for surface coating of biomaterials is a suitable way for biofunctionalizing scaffolds to enhance jaw periosteal cells adhesion and proliferation. The second approach for surface coating of tissue engineering constructs was to generate a specific oligonucleotide for human jaw periosteal cells that can bind and enrich the osteogenic progenitor cells out of the heterogeneous cell population. By an in vitro selection process (SELEX), an aptamer was generated out of a starting library of about 1015 different 80 bp oligonucleotide sequences that can bind to early osteogenic differentiated, but not to adipogenic or chondrogenic differentiated and only weakly to undifferentiated JPCs and also not to any other tested cell types. The amount of positive labelled cells evaluated by flow cytometry was shown to be donor dependent and independent of the patients’ in vitro mineralizing potential. However, testing the binding affinity to other mesenchymal stem cells derived from bone marrow and placenta showed a similar pattern as detected in osteogenic differentiated periosteal cells. In order to evaluate the mineralizing capacity of the aptamer 74-positive in comparison to the negative fraction, the JPCs were sorted and we could not find any significant differences between those two fractions. The biofuncionalization through aptamers is a novel approach in tissue engineering applications and shows a high potential to further development. After the studies done so far, the aptamer 74 does not seem to have any special advantages towards the RGD coating method. Summarizing these results, we can postulate that the indirect coating of linear RGD peptides via a PLL spacer represents a suitable method for surface coating in bone tissue engineering. In the next steps, these constructs have to prove their clinical relevance in an in vivo model.