Design und Synthese von intrazellulären MR Kontrastmitteln mit beta-Galactosidase als Target

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dc.contributor.advisor Ziegler, Thomas (Prof. Dr.) de_DE
dc.contributor.author Brud, Aneta de_DE
dc.date.accessioned 2011-09-26 de_DE
dc.date.accessioned 2014-03-18T10:23:26Z
dc.date.available 2011-09-26 de_DE
dc.date.available 2014-03-18T10:23:26Z
dc.date.issued 2010 de_DE
dc.identifier.other 350724032 de_DE
dc.identifier.uri http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-58163 de_DE
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10900/49579
dc.description.abstract Die Molekulare Bildgebung ist ein schnell wachsendes Forschungsgebiet, dessen Ziel es ist, Werkzeuge zur Visualisierung von spezifischen molekularen und zellulären Prozessen bereit zu stellen. Insbesondere gilt dies, wo auftretende Anomalien zu erblichen, aber nicht nur ausschließlich solchen, Erkrankungen führen. Die Bewertung der wichtigsten molekularen Zielstrukturen in diesen Prozessen mit den nichtinvasiven bildgebenden Methoden könnte ein besseres Verständnis der Herkunft verschiedenerer Krankheiten, ihre Früherkennung sowie die direkte Überwachung von modernen therapeutischen Ansätzen wie Gen-oder Zelltherapie ermöglichen. Zudem ließe sich die Wirksamkeit dieser neuen Therapiemethoden besser beweisen. Unter den verschiedenen bestehenden Bildgebungs-Technologien, ermöglicht die Nutzung der Magnetresonanz-Tomographie (MRT) nicht-invasive Visualisierung solcher biologischer Targets im intakten lebenden Organismus ohne den Einsatz von ionisierender Strahlung und mit einer hohen räumlichen Auflösung. Allerdings erfordert eine solche Bildgebung mittels MRT biokompatible molekulare Substanzen, sogenannte MRT-Kontrastmittel, die spezifisch das Molekül, das den interessierenden Prozess kennzeichnet erkennen können. So können zum Beispiel spezifische Enzyme, die sich im Cytosol befinden und sowohl Indikatoren für die jeweilige Erkrankung, aber auch wichtige Marker der Genexpression sein können, mit Hilfe der MRT detektiert werden. Daher war das Ziel der hier vorgestellten Arbeit die Entwicklung von Zell-permeablen MRT-Kontrastmitteln, die das Enzym beta –Galactosidase als Zielstruktur haben, ein häufig verwendetes Markerprotein, das durch das bakterielle LacZ Reportergen exprimiert wird. Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Entwicklung und mehrstufige Synthese von beta-Galaktosidase-gerichteten bimodal MRI-Kontrastmitteln, basierend auf einer Galaktose-Einheit, eingebaut zwischen MR/optische Imaging Reportern und einem zellpenetrierenden Peptid (CPP) am anomeren Zentrum. Die erhaltenen Konjugate zeigten eine vorteilhaft hohe Relaxivität. Auf der Suche nach Parametern, die die Fähigkeit dieser Substanzen den Kontrast in MR-Bildern zu erhöhen, wurde ebenfalls die Beziehung zwischen der molekularen Struktur und der Relaxivität r1 untersucht. Studien mit Fluoreszenz-Spektroskopie und Mikroskopie zeigten eine deutliche intrazelluläre Aufnahme der Kontrastmittel. Für die Verbindung mit dem CPP D-Tat49-57 konnte eine deutlich bessere Aufnahme in beta-Galactosidase exprimierenden C6/LacZ-Zellen im Vergleich zu C6 Zellen ohne das Enzym beobachtet werden. Obwohl die synthetisierten Kontrastmittel ebenfalls die intrazellulären Relaxationsraten und damit den Kontrast in MR-Bildern erhöhten, wurde vor allem durch ihren endosomalen Aufnahmemechanismus die Interaktionen mit der zytosolischen beta-Galactosidase erheblich behindert. Im zweiten Teil wurde der Einfluss der molekularen Struktur auf die enzymatische Aktivität der beta-Galactosidase untersucht. Um die Parameter zu verstehen, die die Wechselwirkungen von sperrigen intrazellulären MR-Kontrastmitteln mit dem Zielenzym bestimmen, wurde eine Reihe von Modellmolekülen synthetisiert. Dazu wurden Modifikationen des Glycon-Teils durch den Einbau von MR Reportern an C-6-Position der Galactose-Einheit eingeführt und deren Einfluss auf die beta-Galactosidase aufgeklärt. Zusätzlich wurde der Einbau von Peptiden sowie des Fluorophors über verschiedene Spacer an der C-1-Position in Modell Konjugaten untersucht. Es wurde gezeigt, dass sowohl die Substitution an der C-6-Position als auch die Modifikationen am Aglykon-Teil die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion reduzieren. Der dritte Teil der Arbeit beschreibt eine Methode, mit der Makromoleküle mit MR und optischen Reportern in einem einzigen Syntheseschritt gekoppelt werden können. Dieser Ansatz verbindet den Vorteil der Bimodalität mit der Möglichkeit Gadolinium vorab in ein kleines, einfach aufzureinigendes Vorläufermolekül einzubauen, das dann an sperrige Moleküle unter milden Bedingungen werden kann. de_DE
dc.description.abstract Molecular imaging is a rapidly growing field aimed at providing tools for the visualization of specific molecular and cellular processes in particularly those, where occurring abnormalities are leading to hereditary, but not only diseases. The assessment of key molecular targets involved in these processes using noninvasive imaging modalities would enable a better understanding of the origin of various diseases, their early detection as well as allow direct monitoring and revealing the efficacy of modern therapeutic approaches such as gene or cellular therapies. Among various existing imaging technologies, the magnetic resonance imaging (MRI) would particularly allow noninvasive visualization of such biological targets in the intact living organism without the use of ionizing radiation and with high spatial resolution. However, the imaging by means of MRI requires biocompatible molecular probes, so called MRI contrast agents, which can specifically identify targeted molecules that characterize the process of interest. For example, specific enzymes located in the cytosol and being indicators of disease processes but also serving as important gene expression markers could be detected by MRI. Objective of the presented work was the development of cell-permeable MRI contrast agents targeting the enzyme beta-galactosidase, a commonly used marker protein expressed by the bacterial LacZ reporter gene. The first part of this thesis describes the design and multistep synthesis of the bimodal MRI contrast agents targeting beta-galactosidase based on a galactose moiety incorporated between MR/optical imaging reporters and cell penetrating peptides (CPP) attached to the anomeric center. The obtained conjugates showed advantageously high relaxivity. In search for parameters that govern the ability of these probes to enhance contrast in MR images, the relationship between the molecular structure and the relaxivity r1 was also investigated. Fluorescence spectroscopy and microscopy revealed the intracellular localization of these conjugates. The contrast agent with D-Tat49-57 as CPP showed substantially higher levels of intracellular localization in C6/LacZ cells (expressing beta-galactosidase) compared to C6 cells without the enzyme as observed by optical imaging. Although the synthesized contrast agents could efficiently enhance intracellular relaxation rates, their mainly endosomal entrapment significantly hindered the interactions with the cytosolic beta-galactosidase. In the second part the influence of the molecular structure on the enzymatic activity of beta-galactosidase was investigated. In order to understand parameters that determine interactions of bulky intracellular MR contrast agents with the targeted enzyme, a series of model molecules were synthesized and evaluated. Thus, modifications at the glycon part by the incorporation of MR reporters at C-6 position of the galactose moiety on beta-galactosidase were elucidated. Furthermore, peptide as well as fluorophore incorporation via different spacers at the C-1 position were investigated by model conjugates. Both, substitution at C-6 position as well as the modifications at the aglycone part decreased the rate of enzymatic reaction. The third part describes a method to label macromolecules with MR and optical imaging reporters in a single conjugation step. This approach took advantage of combining bimodality and gadolinium pre-loading in the design of a suitable precursor, which can be appended to bulky molecules using a mild bioconjugation protocol. en
dc.language.iso de_DE de_DE
dc.publisher Universität Tübingen de_DE
dc.rights ubt-podok de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=de de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=en en
dc.subject.classification Peptidsynthese de_DE
dc.subject.ddc 540 de_DE
dc.subject.other Telluläre Bildgebung , Intrazelluläres MRT-Kontrastmittel de_DE
dc.subject.other Solid phase synthesis , Cellular imaging , Intracellular MRI contrast agent en
dc.title Design und Synthese von intrazellulären MR Kontrastmitteln mit beta-Galactosidase als Target de_DE
dc.title Design and Synthesis of Intracellular MR Contrast Agent Targeting beta-Galactosidase en
dc.type Dissertation de_DE
dcterms.dateAccepted 2009-11-04 de_DE
utue.publikation.fachbereich Chemie de_DE
utue.publikation.fakultaet 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät de_DE
dcterms.DCMIType Text de_DE
utue.publikation.typ doctoralThesis de_DE
utue.opus.id 5816 de_DE
thesis.grantor 14 Fakultät für Chemie und Pharmazie de_DE

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