Optimierung massenspektrometrischer Methoden zur Identifizierung von HLA-Liganden und ihre Anwendung in der klinischen Forschung

Abstract

T-Zellen spielen bei der Abwehr und Eliminierung von Pathogenen im Körper eine wichtige Rolle. Um entscheiden zu können, welche Körperzelle gesund und welche Körperzelle krank oder entartet ist, gibt es spezielle membranständige Proteinkomplexe auf den Zelloberflächen, die sogenannten Haupthistokompatibilitätskomplexe (MHC von engl. Major Histocompatibility Complex), über die es den T-Zellen möglich ist, den Gesundheitszustand der Zelle zu überwachen. Die Aufgabe der MHC-Moleküle besteht darin, das Proteom einer Zelle in Form von Peptiden, den MHC-Liganden, auf der Zelloberfläche zu präsentieren, so dass den T-Zellen auf diese Weise ein Blick in das Innere der Zellen gewährt wird. Erst diese Art der Peptidpräsentation führt zur T-Zell-Erkennung, welche die Unterscheidung zwischen Selbst- und Fremdantigenen sowie zwischen normalen und entarteten Zellen ermöglicht. Zur Identifizierung und Sequenzierung von MHC-Liganden ist die Massenspektrometrie derzeit unumgänglich. Aufgrund der geringen Probenmengen, die für solche Art Analysen in der Regel zur Verfügung stehen ist es notwendig, die Massenspektrometer sowie die zur Probentrennung vorgeschaltete Hochleistungsflüssigkeitschromatographieanlage bestmöglich aufeinander abzustimmen, um eine größtmögliche Anzahl an Liganden zu charakterisieren. In diesem Zusammenhang wurde auch eine Software getestet, über die diese Sequenzierung automatisiert ablaufen soll. Auf diese Weise war es möglich, über 750 verschiedene Peptidsequenzen, die von 500 µl pelletierter Zellen der B-lymphoblastoiden Zelllinie JY isoliert wurden, eindeutig zu identifizieren. Auf Gebieten der klinischen Forschung war es möglich, mehr als 300 Liganden, die auf Gehirngewebe von Patienten mit Multipler Sklerose präsentiert wurden, zu sequenzieren. Darunter waren auch einige Peptide, die aus Proteinen wie beispielsweise dem Myelin-Basischen Protein stammen, welche in Verdacht stehen, mit dieser Autoimmunerkrankung assoziiert zu sein. Des Weiteren wurde die Methode zur Detektion tumorassoziierter MHC-Peptide auf Zellen oder soliden Geweben verbessert, indem über eine Software vorhergesagte oder bereits bekannte Liganden synthetisiert und nach differentieller N-terminaler Isotopenmarkierung als Eichpeptide einem natürlichen Ligandengemisch als Vergleichsprobe zugesetzt wurden. Über diesen Ansatz wurden zwei Peptide, die aus dem tumorassoziierten Protein Survivin stammen, eindeutig identifiziert.

T cells play an important role in defence and elemination of pathogens in humans. In order to perceive, which cells are healthy and which ones are infected or abnormal, special membrane protein complexes on the cell surface, the so-called major histocompatibility complexes (MHC), help the T cells to monitor the cells’ state of health. The MHC-molecules present the proteome of a cell on its surface in the form of peptides called MHC ligands. On this way, T cells are able to take a look inside the cell. The presentation of these peptides leads to the T-cell recognition, which enables the discrimination between self- and non-self antigens and between normal and abnormal cells. Mass spectrometry is currently inevitable for the identification and secuencing of MHC-ligands. Because of the low amount of analyte, which is usually available for these kind of analysis, it is necessary to coordinate the mass spectrometer to the high pressure liquid chromatography (HPLC) system responsible for sample separation in order to get the highest number of ligands characterised. In this context a software, which automatises the peptide sequencing has been tested. In this way, it was possible to identify more than 750 peptide sequences isolates from 500 µl of pelleted cells of the B-lymphoblastoid cell line JY. On the field of clinical research, it was possible to sequence more than 300 ligands presented on brain tissue of patients with multiple sclerosis. Amongst these peptides, some of them are originated from proteins like the myelin basic protein, which are under suspicion to be associated with this autoimmune disease. Furthermore, a method for the detection of tumor-associated MHC-peptides on cell surfaces or on solid tissues has been improved by synthesizing known or software-predicted ligands to use them – after differential N-terminal stable isotope labelling – as calibrants in a mixture of natural ligands. In this manner, two peptides derived from the tumor-associated protein survivin could be identified.