Charakterisierung der MreB homologen Proteine während der morphologischen Differenzierung in Streptomyces coelicolor A3(2)

Abstract

Obwohl Streptomyceten durch apikales Spitzenwachstum ein verzweigtes Myzel ausbilden, besitzen sie ein mre-Gencluster, das bei stäbchenförmigen Bakterien für die laterale Zellwandsynthese verantwortlich ist und so die Ausbildung der Stäbchenform bewerkstelligt. Dabei wird der Zellwand- synthesekomplex durch Aktin-homologe Proteine (MreB, Mbl, MreBH) positioniert. S. coelicolor kodiert für drei MreB homologe Proteine: MreB, Mbl und SCO6166. In RT-PCR Experimenten konnte gezeigt werden, dass die drei mreB-ähnlichen. Gene unterschiedliche Expressionsprofile aufweisenmreB wird bereits im Substratmyzel exprimiert und während der Differenzierung hochreguliert. Das Gen mbl wird zunächst schwach exprimiert und die Expression steigt kontinuierlich mit Zunahme des Differenzierungsgrades an. sco6166 zeigt eine gegenläufige Expression. Es wird stark im Substratmyzel exprimiert und nimmt im Laufe derSporulation stark ab. Die Deletion von sco6166 führte zu keiner phänotypische Veränderung im Vergleich zum Wildtyp. Das Fusionsprotein SCO6166-mCherry zeigte eine starke, allerdings unspezifische Fluoreszenz im Substratmyzel, es war jedoch keine Fluoreszenz im Luftmyzel oder in Sporen zu detektieren. Das Protein hat unter den getesteten Bedingungen keine Funktion während der Sporulation. Phänotypische Untersuchungen der Deletionsmutanten verschiedener Gene des mre-Clusters (mreB, mreC, mreD, pbp2 und sfr) sowie von mbl ergaben Hinweise auf eine Beteiligung aller Gene an der Ausbildung einer resistenten Sporenwand. Alle Mutanten produzierten geschwollenen Sporen, die vorzeitig auskeimten und die für Streptomycetensporen charakteristische Resistenz gegen Hitzestress und osmotischen Stress weitgehend verloren hatten. Mit Hilfe von Lokalisationsstudiendurch Fluoreszenzmikroskopie von MreB-eGFPund Mbl-mCherry konnte gezeigt werden, dass diese beiden Proteine eine Rolle während derSporenwandbildung besitzen. Sowohl MreB als auch Mbl lokalisierenzunächst an den Septen des Luftmyzels und assemblieren anschließend unterhalb der Sporenwand. Auch eine Co-Lokalisation von MreB und Mbl an den Septen konnte gezeigt werden. Während MreB unabhängig von Mbl, MreC oder PBP2 an den Septen lokalisieren kann, ist die Lokalisation von Mbl abhängig von MreB. Diese Ergebnisse weisen daraufhin, dass sowohl MreB als auch Mbl an der Bildung einer stressresistenten Sporenwand beteiligt sind. SCO6166 ist nicht an der Sporulation in S. coelicolor beteiligt, seine Funktion in Streptomyceten ist bislang noch unklar.

The majority of rod-shaped bacteria contain an actin-like cytoskeleton consisting of MreB polymers which form helical spirals underneath the cytoplasmic membrane to direct peptidoglycan synthesis for elongation of the cell wall. In contrast, MreB of Streptomyces coelicolor is not required for vegetative growth, but has a role in sporulation. Beside MreB, S. coelicolor encodes two further MreB-homologous proteins, Mbl and SCO6166, whose function is unknown. Whereas MreB and Mbl are highly similar, SCO6166 is shorter, lacking subdomains IB and IIB of actin-like proteins. We showed that MreB and Mbl are not functionally redundant but cooperate in spore wall synthesis. Expression analysis by semi-quantitative RT-PCR revealed distinct expression patterns. mreB and mbl are predominantly induced during morphological differentiation, whereas sco6166 is strongly expressed during vegetative growth but switched off during sporulation. In contrast to rod shaped bacteria, deletion of mreB and/or mbl is tolerated in S. coelicolor. Vegetative growth was not affected but parts of the aerial hyphae lysed, spores were swollen and germinated prematurely. The mutants were also more sensitive to high salt concentrations. Whereas S. coelicolor M145 was still able to grow on LB supplemented with 6% NaCl, growth of mreB or mbl mutants was abolished. Deletion of sco6166 had no effect on morphological differentiation and its role in sporulation is unclear up to now. During aerial mycelium formation an Mbl-mCherry fusion protein colocalized with an MreB-eGFP fusion protein at the sporulation septa. Whereas MreB-eGFP localized properly in the mbl mutant, Mbl-mCherry localization depended on the presence of a functional MreB protein. Our data suggest that Streptomyces requires mreB and mbl for morphological differentiation probably to build up a thickened peptidoglycan spore wall able to resist detrimental environmental conditions.