Mesenchymale stromale Vorläuferzellen aus dem Knochenmark zur Regeneration chondrogener Gewebe – eine in vitro Betrachtung

Abstract

Vorläuferzellen, welche aus adultem Gewebe isoliert werden können, haben das Potential, in verschiedene Gewebezellen zu differenzieren. In der vorliegenden Arbeit wurde die Differenzierung zu einem chondrozytären Phänotyp untersucht, wobei hierfür humane mesenchymale stromale Voräuferzellen (MSCs) des Knochenmarks verwendet wurden. Als Zellträger wurden Gelatinegele ausgewählt, und deren Eignung als Differenzierungsmatrix getestet und bestätigt. MSCs wurden dafür in vitro in geringer Zelldichte in diese Hydrogele eingebettet und chondrogen differenziert. Über mehrere Wochen hinweg konnten vitale Zellen detektiert werden. Die Synthese von Extrazellulärmatrix und die Expression von Genen, welche ebenso in Bandscheibenzellen und in Chondrozyten des hyalinen Knorpels exprimiert werden, bestätigten die erfolgreiche Chondrogenese der Zellen in den Gelen. Auffallend war, dass bereits die Isolierungs- und Expansionsbedingungen für undifferenzierte MSCs einen Einfluss auf die Qualität der Differenzierung nahmen. Auch konnte eine Verbesserung der Chondrogenese erreicht werden, wenn MSCs bei 4 % Sauerstoff kultiviert wurden. So zeigten hypoxisch expandierte MSCs bei anschließender Differenzierung verstärkte Ablagerungen sulfatierter Glykosaminoglykane im Vergleich zu den normoxisch expandierten. Die Fähigkeit der MSCs, eine knorpelspezifische Matrix aufzubauen, eröffnet die Möglichkeit für regenerative Therapien von Knorpelgewebe, wie z. B. der degenerierten Bandscheibe. Hinsichtlich der Anwendung in der Regenerationsmedizin muss beachtet werden, dass die im Labor entwickelten Protokolle nicht unmittelbar klinisch eingesetzt werden können. Um die Differenzierungsprotokolle für klinische Anwendungen zu optimieren, wurde aus diesem Grund in der vorliegenden Arbeit die Notwendigkeit von Dexamethason bei der Differenzierung überprüft. Die Ergebnisse zeigen, dass die Expression von Chondrozytenmarkern und die Ablagerung sulfatierter Glykosaminoglykane ohne Dexamethasonzusatz erhöht wurden, so dass während der Differenzierung auf das Glukokortikoid verzichtet werden kann. Neben Dexamethason wurde auch untersucht, ob der Zusatz von TGF-ß3 als Induktor der chondrogenen Differenzierung notwendig ist. Ohne den Zusatz des Zytokins fand keine Differenzierung statt. Es war jedoch möglich den chondrozytären Phänotyp aufrechtzuerhalten, wenn nach zweiwöchiger Differenzierungsphase auf TGF-ß3 verzichtet wurde. Die Expression chondrogener Marker konnte ebenfalls aufrechterhalten werden, wenn die Konzentration des Zytokins kontinuierlich im Verlauf der Differenzierung verringert wurde. Insgesamt ist eine Kombination aus Gelatinehydrogelen und humanen MSCs des Knochenmarks für chondrogene Differenzierungen geeignet, wobei durch Veränderungen der Kultivierungsbedingungen während der Expansions- und Differenzierungsphasen die Differenzierung verbessert werden konnte. Die Differenzierungsprotokolle konnten zusätzlich für Anwendungen in der Medizin angepasst werden.

Progenitor cells isolated from adult tissues are capable of differentiating into a variety of tissue cell types. The differentiation into a chondrocytic phenotype was investigated within this thesis by using human mesenchymal stromal precursor cells (MSCs) from bone marrow as a cell source. Gelatin hydrogels were chosen as cell carriers and the suitability of these gels as a matrix for differentiation was verified by embedding MSCs at low density into these gels and differentiating them in vitro. Vital cells were detectable for several weeks. The success of the differentiation was validated by the synthesis of extracellular matrix and the expression of genes which could also be found in intervertebral disc cells and in chondrocytes of hyaline cartilage. One remarkable fact is that the existing conditions during MSC isolation and expansion already had an impact on the quality of chondrogenic differentiation. In addition, chondrogenesis could be improved by decreasing the oxygen tension to 4 % during culture of MSCs. MSCs which were expanded under hypoxia showed an increased deposition of sulphated glycosaminoglycans after differentiation compared to their normoxic equivalents. The capability of MSCs to produce a cartilage-like matrix provides the opportunity to use these cells in regenerative therapies for cartilaginous tissues (e. g. the treatment of degenerated intervertebral discs). For this purpose it is needed to take into account that the laboratory-developed protocols are not suitable for clinical applications instantaneously. Therefore, differentiation protocols were optimized for clinical applications by examining the necessity of the addition of dexamethasone for a successful differentiation. The results show an increased expression of chondrocytic markers and an increased deposition of sulphated glycosaminoglycans after differentiation without the addition of dexamethasone. Hence, there is no necessity to add the glucocorticoid to the medium. The necessity of the addition of TGF-ß3 as inductor of chondrogenic differentiation was examined as well. There was no chondrogenic induction when the cytokine was omitted. However, the chondrocytic phenotype could be sustained when TGF-ß3 was removed after two weeks of culture. Additionally, chondrocytic marker gene expression was sustained when the concentration of the cytokine was decresed successively during differentiation progress. In summary, a combination of gelatin hydrogels and human bone marrow-derived MSCs is beneficial for chondrogenic differentiation. Changes of culture conditions during expansion and differentiation stages led to an improved outcome of differentiation results. In addition, the protocols for differentiation could be adapted for applications in clinics.