Comparative Analysis of Ha-ras and B-raf Mutated Mouse Liver Tumors and Molecular Mechanisms of Phenobarbital-dependent Tumor Promotion

Abstract

Chemically induced mouse liver tumors are frequently mutated in genes encoding Ha-ras, B-raf or Ctnnb1, leading to constitutive activation of signaling pathways downstream of the respective regulatory proteins affected by mutation of their genes. While Ctnnb1 mutations are highly prevalent in tumors induced by a treatment regimen including PB or a PB-like liver tumor promoter, Ha-ras or alternatively B-raf mutations are seen in up to 70% of spontaneously occurring liver tumors or in tumors induced by exclusive treatment with a genotoxic liver carcinogen like DEN. Analyzing the global protein expression pattern of Ha-ras and B-raf mutated mouse liver tumors discovered no significantly differentially expressed proteins between these tumors types. Furthermore the expression profiles were highly correlated to a recently performed micro-array analysis of the same tumor material. Despite the high similarity in global protein and gene expression, the tumor types differed in the phosphorylation state of ERK1/2, albeit without apparent consequences on protein or gene expression levels. Using two transgenic mouse strains, one expressing a liver specific constitutively active form of beta-catenin and the other lacking a functional form of the proto-oncogene, the importance of beta-catenin in PB-dependent tumor promotion was assessed in vivo, showing that beta-catenin is an essential molecule in this process. Analyzing the liver-proteomes of these animals revealed that PB induces a beta-catenin-mimetic effect in livers of β-catenin-KO mice treated with the tumor promoter. To assess the impact of a mixture containing dioxin-like and PB-like tumor promoters, equipotent doses of PCB 126 and PCB 153 were given, either as a single substance or in a mixture of both substances, to mice initiated with DEN at the age of 6 weeks. As a result, animals receiving the combined mixture of PCB126 and PCB 153 displayed a statistically significant increase in relative lesion size and number when compared to control animals or treatment groups receiving either PCB 126 or PCB 153 only. The increased tumor promotional effect was accompanied by statistically significant and synergistic increases in Cyp1A1 as well as Cyp2B10 gene expression levels. However, protein levels, enzyme assays specific for CYP1A1 and CYP2B10 as well as immunohistochemical analysis revealed increased expression/ activity levels for CYP1A1 in the combined PCB treatment group only. Therefore it seems possible that in a combined PCB 126/153 application PB-like PCB 153 enhances PCB 126 dependent tumor promotion in livers of mice initiated with DEN at the age of 6 weeks. Finally, MRI-technology was utilized for in vivo visualization of mouse liver tumors, showing that tumors as small as 2mm in diameter can be displayed by this technology and that tumor growth varies substantially within and between animals.

Durch Chemikalien induzierte Mauslebertumoren weisen häufig eine Mutation in den Genen Ha-ras, B-raf oder Ctnnb1 auf, was zu einer konstitutiven Aktivierung von Signalwegen unterhalb des von der Mutation betroffenen regulatorischen Proteins führt. Während die Induktion von Ctnnb1 Mutationen häufig in Tieren durch eine Behandlung mit PB oder PB-ähnlichen Substanzen mit tumorpromovierender Wirkung induziert wird, kommen Ha-ras oder alternativ B-raf Mutationen in 70% von spontan entstehenden Tumoren oder nach Behandlung mit dem gentoxischen Leberkanzerogen DEN vor. Die Untersuchung des gesamten Proteinexpressionsmusters von Ha-ras und B-raf mutierten Mauslebertumoren ergab, dass es keine signifikanten Unterschiede in der Proteinexpression zwischen diesen Tumortypen gibt. Darüber hinaus waren die Proteinexpressionsprofile im Vergleich zu einer erst kürzlich durchgeführten RNA-Mikro-Array-Analyse desselben Tumormaterials hoch korreliert. Ungeachtet der ausgeprägten Übereinstimmung in der Protein- und Geneexpression wiesen die Tumortypen einen Unterschied im Phosphorylierungsstatus von ERK1/2 auf, der jedoch keine erkennbaren Auswirkungen auf die Protein- und Genexpression hatte. Der Einfluss von β-Catenin auf die PB-abhängige Tumorpromotion wurde mit Hilfe von zwei transgenen Mausstämmen untersucht, von denen einer eine konstitutiv aktive Form von beta-Catenin exprimierte während bei dem anderen eine funktionsfähige Form des Proto-onkogens fehlte. Die Ergebnisse des Versuchs zeigten, dass beta-Catenin ein essentielles Protein in diesem Prozess ist. Eine Untersuchung des Leber-proteoms dieser Tiere zeigte darüber hinaus, dass PB in Lebern von beta-Catenin-defizienten Tieren eine beta-Catenin-mimetische Wirkung besitzt. Um den Einfluss einer Mischung aus einem Dioxin-ähnlichen und einem PB-ähnlichen Tumorpromotor zu untersuchen, wurden equipotente Dosierungen von PCB 126 und PCB 153 entweder als Einzelsubstanzgabe oder im Gemisch beider Substanzen Tieren verabreicht, welche im Alter von 6 Wochen mit DEN behandelt worden waren. Die Ergebnisse des Versuchs zeigten, dass Mäuse, welche mit der Mischung aus PCB 126 und PCB 153 behandelt wurden, eine statistisch signifikante Erhöhung der relativen Lesionsgrößen und Anzahl, im Vergleich zu Kontrolltieren oder Tieren welche eine Einzelsubstanzgabe erhielten, aufwiesen. Der erhöhte tumorpromovierende Effekt wurde durch eine statistisch signifikante erhöhte Genexpressionsrate von Cyp1A1 und Cyp2b10 begleitet. Sowohl das Ausmaß der Proteinexpression sowie enzymatische Tests der CYP1A1 und CYP2B10 Aktivität als auch immunohistochemische Analysen wiesen eine erhöhte Expression bzw. Aktivität für CYP1A1 nur in der kombinierten PCB126/153-Behandlungsgruppe auf. Daher wäre es möglich, dass bei gemeinsamer Applikation von PCB 126/ PCB 153 das PB-ähnliche PCB 153 einen verstärkenden Effekt auf die PCB 126-abhängige Tumorpromotion in der Mauslebern bewirkt. Als letztes wurde die MRI-Technologie eingesetzt, um Mauslebertumore unter in vivo Bedingungen zu beobachten. Es konnte zum einen gezeigt werden, dass Tumore ab einem Durchmesser von ~2mm dargestellt werden können, zum anderen, dass sich das Tumorwachstum zwischen, aber auch innerhalb eines Tieres substantiell voneinander unterscheiden kann.