N-terminal Regulatory Domains of Phosphodiesterases 1, 4, 5 and 10 examined with an Adenylyl Cyclase as a Reporter

Abstract

Alpha-helical linker regions between tandem GAF domains in PDE5 and 10 are essential for intramolecular signal transmission through subtle interactions between upstream and downstream GAF domains. Mutations within the first ten amino acids of the linker region S231-A366 of PDE10 into corresponding amino acids of PDE5 resulted in enzyme activation and loss of cAMP regulation. C240Y mutation was identified as one of them responsible for this effect and probably for the specific interactions within GAF tandem domains. Beside tandem GAF domains from PDE2, 5, 10 and 11, N-terminal tandem domains from PDE1 – CaM-binding domains and PDE4 – UCR domains can regulate CyaB1 AC. PDE1A3-CyaB1 AC chimera was 2.1 and PDE1B1-CyaB1 AC was 4.4-fold stimulated by CaM, what is similar to the already reported values for CaM stimulation of these holoenzymes. PDE4A4-, B1- and D3- CyaB1 AC chimeras were activated by phosphomimetic mutation of serine from the phosphorylation motif at the beginning of UCR1, 2, 2.1, and 3.8-fold, respectively, similarly as the reported activation of the holoenzymes by serine phosphorylation. Successful substitutions of tandem GAF domain from cyanobacterial AC by different tandem domains of human PDEs indicates that molecular mechanisms which regulate enzyme activity upon modifications from N-terminal domains are conserved and similar in all PDEs and established early in the evolution. Recently solved crystal structure of near full length hPDE2 helped in elucidating this mechanism. It is possible that N-terminal domains of different PDEs regulate access to the substrate binding pocket as the way of regulation catalytic activity.

Alpha-helicale Linkerregionen zwischen Tandem GAF-Domänen in PDE5 und 10 sind unerlässlich für die intramolekulare Signalweiterleitung aufgrund der fein abgestimmten Interaktionen zwischen vor- und nachgeschalteten GAF-Domänen. Mutationen im Bereich der ersten 10 Aminosäuren der Linkerregion S231-A366 von PDE10 in die entsprechenden Aminosäuren von PDE5 hatten Enzymaktivierung und Verlust der cAMP-Regulierung zur Folge. Die Mutation C240Y hat sich als für diesen Effekt verantwortlich herausgestellt und ist möglicherweise auch für die spezifischen Interaktionen innerhalb der Tandem GAF-Domänen verantwortlich. Neben der Tandem GAF-Domänen von PDE2, 5, 10 und 11 können auch N-terminale Tandem-Domänen von CaM-Bindedomänen aus PDE1 und UCR-Domänen aus PDE4 die AC von CyaB1 regulieren. Die Chimäre PDE1A3-CyaB1 AC zeigte 2,1-fache und PDE1B1-CyaB1 AC 4,4-fache Stimulierung durch CaM, was mit den bereits bekannten Werten für CaM-Stimulierung dieser Holoenzyme übereinstimmt. PDE4A4-, B1- und D3- CyaB1 AC-Chimären konnten durch phosphomimetische Mutation von Serin im Phosphorylierungs-Motiv am Anfang der UCR1-Domäne 2-fach, 2,1-fach bzw. 3,8-fach aktiviert werden, was der beschriebenen Aktivierung der Holoenzyme durch Serin-Phosphorylierung entspricht. Die Tandem GAF-Domäne der cyanobakteriellen AC konnte erfolgreich durch verschiedene Tandem-Domänen der humanen PDEs ersetzt werden. Dies deutet darauf hin, dass molekulare Mechanismen, die die Enzymaktivität durch Modifizierung der N-terminalen Domänen regulieren, konserviert und in allen PDEs ähnlich sind und sich früh in der Evolution ausgebildet haben. Die kürzlich gelöste Kristall-Struktur der fast kompletten hPDE2 war bei der Aufklärung dieses Mechanismus hilfreich. Möglicherweise regulieren N-terminale-Domänen verschiedener PDEs die Zugänglichkeit zur Substrat-Bindetasche über die Regulierung der katalytischen Aktivität.