The role of annexin A1 in secondary necrosis

Abstract

Everyday, in multicellular organisms several billions of cells die by programmed cell death type 1, apoptosis, whereby tissue homoeostasis is guaranteed. Dying and dead cells are engulfed by professional phagocytes without activation of proinflammatory immune responses. A multitude of signal molecules are involved in the recognition and the elimination of apoptotic cells. They can be divided on basis of their function into 'find-me' and 'eat-me' molecules, bridging proteins and their corresponding phagocyte receptors. The coordinated interaction of these signal molecules is a requirement for the timely removal of apoptotic cells. In case of dysfunctions in the clearance of dying cells, apoptotic cells undergo secondary (post-apoptotic) necrosis, which is characterized by release of the intracellular content due to proceeding loss of cell membrane integrity. Potentially cytotoxic and antigenic intracellular contents are able to induce proinflammatory immune responses, which can lead to the development of chronic inflammation and autoimmune diseases. The causes of the transition to secondary necrosis can be of different nature. For example, disfunctions in the elimination of apoptotic cells or high apoptosis rates, overwhelming the available scavenging capacity can play an important role. In the present thesis, it could be shown, that the bridging protein annexin A1 (anx A1), which was previously described in the context of different immunological processes, plays an important role in the elimination of post-apoptotic secondary necrotic cells and the post-phagocytic immune response. In the first part of this thesis, the role of anx A1 should be investigated in the context of phagocytosis of dying cells and the post-phagocytic immunological response. Anx A1 is an intracellular protein, which is known to be involved in efficient dying cell clearance. Consistent with its function as a bridging molecule in the phagocytic synapse, we could show that recognition and engulfment of apoptotic cells by professional phagocytes can be enhanced by addition of exogenous purified anx A1. In a detailed analysis we could show that anx A1 is only slightly externalized on the apoptotic cell surface but strongly exposed by secondary necrotic cells. The phagocytosis level of secondary necrotic cells could not be enhanced by addition of exogenous anx A1. Most interestingly, we could demonstrate that anx A1 externalisation on secondary necrotic cells strongly influenced the post-phagocytic response when these cells were ingested by macrophages. It could be clearly demonstrated that engulfment of secondary necrotic anx A1 externalizing cells resulted in a strongly reduced proinflammatory cytokine production in comparison to secondary necrotic cells, not exposing anx A1 on their cell surface. These results suggest that externalization of anx A1 during secondary necrosis displays an important failsafe mechanism to counteract against proinflammatory reactions, even when timely removal of apoptotic cells is impaired. In the second part of this thesis, it could be initially observed that only certain cell types externalized anx A1 after induction of secondary necrosis, and and that anx A1 externalization was accompanied by its proteolytical cleavage. In further investigations, the ‘a disintegrin and metalloprotease’ 10 (ADAM10) was identified to be responsible for anx A1 processing within its unique N-terminal domain. Thereby a small peptid of 6 amino acids was generated and released from the secondary necrotic cell surface. Most interestingly, this anx A1 N-terminal derived peptide was able to induce THP-1 monocytes recruitment. This observation was experimentally substantiated by a strong reduction of THP-1 transmigration to secondary necrotic cell culture supernatants when anx A1 or ADAM10 expression was silenced by administration of specific small interfering RNAs. Hence, the exposure and the proteolytic cleavage of anx A1 obviously represent final events of apoptosis, which after transition to secondary necrosis lead to monocyte recruitment to the site of impaired apoptotic cell clearance. Thus, anx A1 executes several functions in the elimination of dying cells: (I) as 'find-me' signal, released from secondary necrotic cells to recruit phagocytes, (II) as 'eat-me' signal, exposed on the cell surface to enhance binding between dying cell and phagocyte, and (III) as 'anti-inflammatory' mediator, reduced proinflammatory cytokine production after engulfment of secondary necrotic cells by the phagocyte. These newly described functions of anx A1 could have an important impact on novel therapeutic strategies for the treatment of chronic inflammatory processes and autoimmune diseases.

In mehrzelligen Organismen sterben täglich mehrere Milliarden Zellen durch den programmierten Zelltod Typ1, Apoptose, wodurch eine Aufrechterhaltung der Gewebshomöstase gewährleistet wird. Die sterbenden und toten Zellen werden durch professionelle Phagozyten beseitigt, ohne das Immunsystem zu aktivieren. Eine Vielzahl an Signalmolekülen ist an der Erkennung und Eliminierung sterbender Zellen beteiligt. Diese werden anhand ihrer Funktion in 'find-me', und 'eat-me' Moleküle, Brückenproteine und ihre entsprechenden Rezeptoren unterteilt werden. Das koordinierte Zusammenspiel dieser Signalmoleküle ist die Voraussetzung für die rechtzeitige Beseitigung apoptotischer Zellen. Werden apoptotische Zellen durch eine Störung nicht rechtzeitig eliminiert, dann gehen sie in das Stadium der sekundären Nekrose über. Diese ist charakterisiert durch die Freisetzung des intrazellulären Inhalts auf Grund der fortscheitenden Durchlässigkeit der Zellmembran und kann zur Induktion von chronischen Entzündungen und / oder Autoimmunerkrankungen führen. Die Ursachen für das Auftreten sekundärer Nekrose können unterschiedlicher Natur sein. Störungen bei der Eliminierung apoptotischer Zellen oder massive Apoptoseinduktion, die die verfügbare Phagozytosekapazität überschreitet, können eine entscheidende Rolle spielen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Brückenprotein Annexin A1 (anx A1), das bereits im Zusammenhang mit verschiedenen immunologischen Prozessen beschrieben wurde, bei der Eliminierung sekundär nekrotischer Zellen und der anschließenden Immunantwort eine wichtige Rolle spielt. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte die Rolle von anx A1 im Zusammenhang mit der Phagozytose sterbender Zellen und der post-phagozytären Immunantwort untersucht werden. Anx A1 ist ein intrazelluläres Protein, das mit der effizienten Eliminierung apoptotischer Zellen in Verbindung gebracht wird. Übereinstimmend mit seiner Funktion als Brückenmolekül in der phagozytotischen Synapse konnten wir zeigen, dass die Erkennung apoptotischer Zellen durch die exogene Zugabe von gereinigtem anx A1 die Aufnahme durch professionelle Phagozyten deutlich verstärkte. In einer detaillierten Analyse stellte sich heraus, dass anx A1 nur schwach von apoptotischen Zellen aber sehr stark von sekundär nekrotischen Zellen auf die Zelloberfläche externalisiert wurde. Die Phagozytose sekundär nekrotischer Zellen wurde durch Zugabe von gereinigtem anx A1 jedoch nicht verstärkt. Interessanterweise, konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Externalisierung von anx A1 auf der Zelloberfläche von sekundär nekrotischen Zellen die post-phagozytäre Immunantwort von Macrophagen beeinflusste. Es wurde eindeutig nachgewiesen, dass nach Aufnahme sekundär nekrotischer Zellen durch Macrophagen, diese in Anwesenheit von anx A1 deutlich weniger proinflammatorische Zytokine freisetzten als in Abwesenheit von anx A1 auf der sekundär nekrotischen Zelloberfläche. Die Ergebnisse im ersten Teil dieser Arbeit zeigten, dass die Externalisierung von anx A1 während der sekundären Nekrose einen wichtigen Notfallmechanismus darstellen, der Entzündungsreaktionen entgegen wirkte, gerade dann wenn die rechtzeitige Aufnahme apoptotischer Zellen nicht gewährleistet war. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, konnten wir zu Beginn beobachten, dass die Externalisierung von anx A1 nach Induktion der sekundären Nekrose nur in bestimmten Zelltypen erfolgte, und mit einer proteolytischen Prozessierung von anx A1 auf der Zelloberfläche einherging. In den folgenden Untersuchungen wurde die Metalloprotease ADAM10 als diejenige Ectoprotease identifiziert, die anx A1 in seiner einzigartigen N-terminalen Domäne prozessierte. Dies führte zur Freisetzung eines kleinen Peptides von der Oberfläche sekundär nekrotischer Zellen, das in der Lage war, THP-1 Monozyten zu rekrutieren. Diese Beobachtung konnte durch eine deutlich reduzierte Transmigration auf Zellkulturüberstände sekundär nekrotischer Zellen, in denen die anx A1 oder die ADAM10 Expression inhibiert wurde, bestätigt werden. Die Externalisierung und die proteolytische Prozessierung von anx A1 stellen damit ein finales Ereignis während der Apoptose dar, das nach dem Übergang in die sekundäre Nekrose zur Anlockung von Monozyten beiträgt. Anx A1 hat daher offensichtlich mehrere Funktionen bei der Entsorgung sterbender Zellen: (I) als 'find-me' Signal, das von sekundär nekrotischen Zellen freigesetzt wird, (II) als 'eat-me' Signal, das die Bindung zwischen sterbender Zelle und Phagozyt unterstützt und (III) eine 'anti-inflammatorische' Funktion bei der Beseitigung sekundär nekrotischer Zellen. Da Defekte in der Eliminierung apoptotischer Zellen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung bestimmter Autoimmunerkrankungen spielen, eröffnen diese neu beschriebenen Funktionen von anx A1 potentielle Perspektiven für die Entwicklung neuer Therapien von Autoimmunerkrankungen oder chronisch entzündlichen Prozessen.