New aminocoumarin antibiotics from genetic engineering, and their biological activities

Abstract

Aminocoumarin antibiotics like clorobiocin and novobiocin produced by different Streptomyces strains are potent inhibitors of DNA gyrase. Although novobiocin has been licensed for clinical use in human infections with Gram-positive bacteria such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains, the clinical application of these antibiotics remains restricted. One reason is their low activity against Gram-negative pathogens. Therefore, it is of interest to test whether structurally modified aminocoumarin derivatives are able to overcome the limitations. One potentially powerful approach could be a Trojan-horse strategy using the iron transport abilities of catechol siderophores in order to carry drugs with catechol motifs into Gram-negative cells. To mimic the siderophore structure, we decided to introduce a catechol moiety - 3,4-dihydroxybenzoic acid (DHBA) - into clorobiocin instead of the genuine prenylated 4-hydroxybenzoyl moiety (Ring A) by genetic engineering. Therefore, a modified clorobiocin gene cluster that lacks an essential gene of the biosynthesis of the genuine Ring A was expressed heterologously in Streptomyces coelicolor M512, together with an expression plasmid containing synthetic genes for 3,4-DHBA biosynthesis. We confirmed the production of the new clorobiocin derivative with the desired catechol moiety (novclobiocin 401) by LC-MS and NMR. In addition, we tested the inhibitory activity of the new compound toward topoisomerases in vitro as well as its antibacterial activity against different Escherichia coli mutant strains. Experiments demonstrated that its influx dependents on intact siderophore transporters. These results demonstrate the viability of this strategy to obtain improved aminocoumarins, and gives further insight into the structure-activity relationship of aminocoumarins relating both to their transport across the cell membranes and to their interaction with the target.

Aminocoumarin-Antibiotika, wie z.B. Clorobiocin oder Novobiocin, die von verschiedenen Stämmen der Gattung Streptomyces gebildet werden, sind sehr potente Gyrase-Inhibitoren. Obwohl Clorobiocin der potentere Wirkstoff gegen die bakterielle Gyrase ist, ist einzig Novobiocin in den USA als humantherapeutisches Reserveantibiotikum zugelassen. Ein Grund hierfür ist die geringe Aktivität gegen Gram-negative Bakterien. Strukturell veränderte Aminocoumarin-Derivate bieten daher eine viel versprechende Möglichkeit neue Aminocoumarin-Antibiotika mit verbesserten Eigenschaften zu entwickeln. Mittels Kombinatorischer Biosynthese wurde ein Clorobiocin-Derivat mit einer siderophor-ähnlichen Struktureinheit hergestellt, mit deren Hilfe der aktive Transport durch die äußere Membran mittels zelleigenen Siderophortransporter genutzt werden sollte. Hierfür wurde die prenylierte 4-Hydroxybenzoesäure (Ring A) von Clorobiocin durch 3,4-Dihydroxybenzoesäure (3,4-DHBS) ersetzt. Zuvor wurde ein Operon aus zwei synthetischen Genen erstellt, die für eine Pyruvatlyase und eine 4-Hydroxybenzoat-3-hydroxylase kodieren und zusammen für die Biosynthese der 3,4-DHBS verantwortlich sind. Die Gene stammen aus dem Gram-negativen Bakterium E. coli und dem Gram-positiven Bakterium Corynebacterium cyclohexanicum. Die Codons beider Gensequenzen wurden für eine Expression im Wirtsstamm Streptomyces coelicolor M512 optimiert und zusammen mit einem cloQ-defekten Clorobiocin Biosynthesegencluster (verantwortlich für das Ausbleiben der Ring A-Biosynthese) transformiert. Der resultierende Stamm produzierte ein neues Clorobiocin Derivat (Novclobiocin 401) mit der siderophor-ähnlichen Struktureinheit 3,4-DHBS. Die chemische Struktur des neuen Clorobiocin Derivats wurde mittels LC-MS, HR-MS und NMR Analysen bestätigt. Novclobiocin 401 erwies sich als potenter Hemmstoff der bakteriellen Gyrase von Escherichia coli und Staphylococcus aureus. Bioassays gegen verschiedene Escherichia coli Mutanten zeigten, dass diese Substanz aktiv durch Catechol-Siderophortransporter in die Zelle transportiert wurde. Anhand dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass neue potente Substanzen bewusst durch „synthetische Biologie“ hergestellt werden können.