The Transmembrane Signaling in Chimeras of the E.coli Chemotaxis Receptors and Bacterial Class III Adenylyl cyclases

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-54840
http://hdl.handle.net/10900/49513
Dokumentart: Dissertation
Date: 2011
Language: English
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biochemie
Advisor: Schultz, Joachim E. (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2011-02-04
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
Keywords: Adenylatcyclase , Domäne , Chemorezeptor , Tsr-Chemorezeptor
Other Keywords:
Signaling , Transmembrane , Chemotaxis Receptors , Adenylyl cyclases , Tsr , Tar
License: Publishing license including print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

Mithilfe von Chimären aus E.coli Chemotaxis-Rezeptoren und verschiedenen bakteriellen Adenylatcyclasen (ACs), die eine gemeinsame molekulare Domänen-Organisation aufweisen, wurde die transmembranäre Signal-Regulierung untersucht. Die Chemotaxis Rezeptoren besitzen einen in der Membran verankerten Rezeptor mit 2 Transmembranspannen, welcher über eine cytoplasmatische HAMP-Domäne mit einer C-terminalen Effektor-Domäne verknüpft ist. Die untersuchten bakteriellen ACs der Klasse III weisen einen hexahelicalen Membrananker auf dessen funktionelle Bedeutung derzeit unbekannt ist. Dieser Membrananker ist über eine cytoplasmatische HAMP-Domäne mit dem katalytischen Teil verbunden. Beide Proteine müssen dimerisieren, um aktiv zu sein. Um für den hexahelicalen Anker bakterieller ACn eine mögliche Rolle als Sinnesrezeptor zu studieren, wurden intramolekulare Netzwerke der Chemotaxis-Rezeptoren Tsr und Tar mit der mycobakteriellen AC Rv3645 und der cyanobakteriellen AC CyaG derartig verknüpft, dass die sensorische Domäne des Chemorezeptors und die Effektor-Domäne der bacteriellen ACs verwendet wurde. Die dazwischen liegende HAMP-Domäne stammte entweder vom Chemorezeptor oder von den ACs. Diese Hybrid-Chimären waren nicht nur enzymatisch aktiv sondern auch in der Lage, Liganden der entsprechenden Rezeptoren zu binden, was zu Regulierung führte. Die Generierung funktioneller Chimären zeigte, dass das einheitliche Konstrukt-Design der Chimären das Register und die Packung der Signal-Entitäten erhalten konnte. Eine Rezeptor-vermittelte Regulierung wurde außerdem bestätigt durch die Einführung von Einzelpunktmutationen im Tsr- und Tar-Rezeptor, die bekanntermaßen die Liganden-Bindung verhindern. Die Einzel-Mutanten R69E und T156K in Tsr und R69E und T154I in Tar verhinderten eine Serin- bzw. Apartat-Regulierung. Durch Co-Expression hingegen wurde die Regulierung wiederhergestellt, wie aufgrund von früheren Chemotaxis-Experimenten vermutet wurde. Ich habe eine bakterielle AC generiert die durch Chemotaxis-Rezeptoren reguliert werden konnte. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass die MCPs und bakterielle ACs einen gemeinsamen Mechanismus für die Signalweiterleitung aufweisen. Der erfolgreiche Austausch von HAMP-Domänen zwischen verschiedenen Chimären zeigte, dass die HAMP-Domänen eines Proteins in der Lage sind, mit heterologen In- und Output-Modulen zu kommunizieren.

Abstract:

Transmembrane signal regulation has been studied using chimeras of E. coli chemotaxis receptors and several bacterial ACs which share a common molecular domain organization. The chemotaxis receptors have a membrane anchored receptor with 2 TMs which is linked via a cytoplasmic HAMP domain to a C-terminal signal output domain. The investigated bacterial class III ACs have a hexahelical membrane anchor whose functional significance currently is unknown, and are linked via a cytoplasmic HAMP domain to the catalytic region. Both proteins need to dimerize for activity. To explore the possible role of the hexahelical anchor of bacterial ACs as sensory receptors, intramolecular networks of the chemotaxis receptors Tsr and Tar were joined with the mycobacterial AC Rv3645 and the cyanobacterial AC CyaG such that the sensory domain was from the chemoreceptor while the output domain from the bacterial ACs. The connecting cytoplasmic HAMP domain was either from the chemoreceptors or the ACs. Such hybrid chimeras were not only enzymatically active but could sense the ligands from the respective receptors because they regulated. Generation of functional chimeras demonstrated that the uniform construct design of the chimeras preserved register and packing of the signaling ensembles. Receptor mediated regulation was further confirmed by inserting single point mutations in the Tsr and Tar receptor segments which are known to abolish ligand binding. The individual mutants R69E and T156K in Tsr and R69E and T154I in Tar abolished serine and aspartate regulation respectively but on co-expression regulation was restored as expected from earlier chemotaxis experiments i.e. I generated a bacterial AC which could be regulated by chemotaxis receptors. The results suggest that the MCPs and bacterial ACs have a common mechanism of signal propagation. Successful swapping of HAMP domains between different chimeras demonstrated that the HAMP domains in one protein could communicate with heterologous input and output modules.

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