Die Rolle Autophagie-assoziierter Proteine in der pflanzlichen Immunantwort

Abstract

Der in Eukaryoten hochkonservierte Prozess der Autophagie erfüllt wichtige Funktionen in der Aufrechterhaltung der Zellhomöostase und als Energielieferant unter nährstoffarmen Bedingungen. Zytosol, beschädigte oder überzählige Organellen und Proteinaggregate werden vom Autophagosom umschlossen, welches nach Transport und Fusion mit der Vakuole/Lysosom dem Abbau zugeführt wird. An diesem Vorgang sind eine Reihe von Autophagie-assoziierten Genen (ATGs) beteiligt und basierend auf Homologien zu Hefe, in der dieser Prozess am besten untersucht ist, konnten 36 ATGs in Arabidopsis thaliana identifiziert werden. Die Autophagie sorgt allerdings nicht nur für ein Gleichgewicht zwischen Biogenese und Abbau in der Zelle, sondern ist auch für die Zelltodregulation bedeutend. Im tierischen und auch im pflanzlichen System wurden sowohl zelltodfördernde als auch zelltodinhibierende Mechanismen beschrieben. In dieser Arbeit sollte daher der Frage nachgegangen werden, wann die Autophagie das Überleben bzw. das Sterben der Zelle begünstigt, beziehungsweise welche Rolle diesem Prozess in der pflanzlichen Immunantwort zukommt. Erste Hinweise einer möglichen Beteiligung der Autophagie in der Immunabwehr lieferten Mikroarray-Analysen, die zeigten, dass die Expression von mehr als einem Drittel der ATGs nach Pathogeninfektion induziert wird, so auch von ATG7 und ATG18a. In einem revers-genetischen Ansatz wurden eine Reihe von Knock-Out bzw. Knock-Down Linien für ATG1c, ATG5, ATG7, ATG10 und ATG18a verwendet, um den Einfluss der Autophagiedefizienz zu analysieren. Nach Infektion mit dem nekrotrophen Pilz Alternaria brassicicola konnten in allen hier untersuchten atg-Mutanten, im Gegensatz zu Wildtyp-Linien, verstärkte Krankheitssymptome beobachtet werden, die mit erhöhten Zelltodraten und vermehrter Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies korrelierten. Dies konnte nicht für den biotrophen Oomyceten Hyaloperonospora arabidopsidis gefunden werden. Nach Behandlung der Blätter mit Fumonisin B1, ein aus nekrotrophen Pilzen isoliertes Toxin, kam es ebenso zu einer Zelltodausbreitung. Schlußfolgernd ließ sich aus diesem Datensatz eine Rolle der Autophagie während krankheitsbedingter Nekrose als einer Zelltodform, hervorgerufen durch nekrotrophe Organismen und deren Toxine, postulieren. Eine mögliche Beteiligung der Autophagie an der bakteriellen Abwehr wurde durch Quantifizierungen des Wachstums verschiedener Pseudomonas-Stämme auf Wildtyp- und atg-Mutanten ermittelt. Nach Analyse von avirulenten Stämmen, Typ III-Sekretionsmutanten, Nichtwirtsstämmen und virulenten Stämmen konnten nur Unterschiede im Wachstumsverhalten nach Infektion mit virulenten Pto DC3000 gefunden werden. Die atg-Mutanten atg5-1, atg10, atg18a-1 und atg18a-2 wiesen eine deutlich erhöhte Resistenz gegenüber diesem Pathogen auf, als es für Wildtyp- und komplementierte Linien der Fall war. Da makros- und mikroskopisch durch Ionenleitfähigkeitsmessungen und Trypanblaufärbungen kein vermehrter Zelltod nach Infektion mit Pto DC3000 nachgewiesen werden konnte, ließ sich die erhöhte Resistenz nicht durch eine erhöhte Zelltodrate und der damit verbundenen Wachstumsreduktion biotropher Erreger erklären. Fortführend wurde nach Veränderungen in der konstitutiven oder induzierbaren Ausprägung der PTI gesucht. Jedoch lieferten nach PAMP-Behandlung weder MAPK-Assays, Stomataöffnungszustände noch Mengen an abgelagerter Kallose Hinweise auf verbesserte Resistenzmechanismen in den atg-Mutanten. Interessanterweise konnte nach Analyse des Hormongehaltes sowie der Expression von Markergenen schon in nicht-infizierten Kontrollblättern der atg-Mutanten eine erhöhte Menge an SA sowie eine vermehrte Expression des SA-abhängigen Markergens PR-1 detektiert werden. Dies könnte dazu beitragen, die erhöhte Resistenz gegenüber Pto DC3000 zu erklären. Diese Arbeit zeigt somit zum einen eine Beteiligung der Autophagie an der Basalresistenz gegenüber nekrotisierenden Pathogenen und belegt des Weiteren eine negative regulatorische Funktion der Autophagie von SA-abhängigen Immunantworten.

Autophagy is a highly conserved degradation process in eukaryotes, and fulfils many important functions within the cell. Under nutrient-poor conditions, this process is necessary for maintaining cell homeostasis and for energy supply. Cytosol, damaged, toxic or superfluous organelles and protein aggregates are enclosed by the autophagosome. After transport, this vesicle fuses with the vacuole for cargo degradation. Numerous autophagy-associated genes (ATGs) have been identified in yeast, many of which have counterparts in plants. The Arabidopsis thaliana genome harbours 36 ATGs. Plant autophagy is not only important for balancing biogenesis and degradation, but also for controlling plant disease and immunity. In Arabidopsis thaliana, autophagy has been assigned both “pro-death” and “pro-survival” roles in controlling programmed cell death. This work aimed at elucidating the circumstances under which autophagy promotes either cell survival or cell death and manifest its role in the plant innate immune response. By analysing microarray data, enhanced accumulation of more than one third of ATG protein encoding transcripts could be found in Pseudomonas syringae pv. tomato-infected plants, suggesting a role in immunity. In a reverse genetics approach using several Knock-out and Knock-down lines for ATG1c, ATG5, ATG7, ATG10 and ATG18a the influence of autophagy deficiency was analyzed. Compared to wild-type lines, infection with the necrotrophic fungus Alternaria brassicicola resulted in enhanced disease symptoms in all atg-mutant lines correlating with enhanced cell death rates and an elevated production of reactive oxygen species. Similar results could not be found for the obligate biotrophic oomycete Hyaloperonospora arabidopsidis, suggesting an impact of autophagy-deficiency only on destructive, necrotrophic pathogens. Supporting this hypothesis, a run-away cell death phenotype was also observed after treatment of leaves with fumonisin B1, a toxin isolated from necrotrophic fungi. Therefore, it can be postulated that autophagy contributes specifically to the containment of chlorosis and cell death triggered by necrotrophic pathogens and their toxins. A possible involvement of autophagy in bacterial resistance was also analyzed by quantification of growth rates of different Pseudomonas strains on wild-type and mutant lines. After analysis of avirulent, secretion-deficient, non-host and virulent strains, an increased resistance could only be found towards virulent Pto DC3000 in the mutant lines atg5-1, atg10, atg18a-1 and atg18a-2. This resistance was not due to elevated levels of host cell death, as measured by ion leakage and trypan blue stainings. Moreover, constitutively activated or induced defense mechanisms were not the reason for the higher resistance phenotype. PAMP treatment did not cause an elevated induction of MAPK in atg mutants compared to wild type plants. PAMP-induced stomata closure in atg mutants was the same as in wild-type lines, and the amount of callose was not elevated in atg-mutants. Interestingly, both non-infected as well as bacteria infected atg genotypes contained slightly elevated levels of the phytohormone salicylic acid and exhibited subtly enhanced expression of the defense marker gene PR-1. This elevated hormone level could contribute to the higher resistance phenotype against Pto DC3000. In summary, this thesis shows that autophagy on one hand functions as an “anti-death” mechanism that impinges on the basal resistance by controlling necrotic cell death development and on the other hand has a negative regulatory function in SA-dependent immune responses.