Origin, biogenesis and non-cell autonomous effect of small RNAs in Arabidopsis thaliana

Abstract

The proper development, the reproduction, the response to environmental signals and even routine cellular processes of an organism depend on the proper regulation of its genome. As a consequence, cells have developed many strategies to control gene expression, ranging from the structure of chromosomes to the stability of proteins. One of the main regulators of gene activity in plants are the so-called small RNAs (sRNAs). These molecules are originated from a double stranded RNA, which is recognized and processed to 19-24 nt long sRNAs by Dicer-like (DCL) proteins. The sRNAs are then loaded into an effector complex called RISC, where they will confer specificity to the system. Gene silencing driven by sRNAs can occur both, at the transcriptional level (transcriptional gene silencing, TGS) or post-transcriptionally (post transcriptional gene silencing, PTGS). TGS is caused by DNA and/or histone methilation at the target sequence, while PTGS relies on the “slicing” of the target sequence or translation repression. sRNAs in plants can be divided in small interfering RNAs (siRNAs) or micro RNAs (miRNAs). siRNAs are originated from perfect double-stranded RNA, which can arise by different sources. On the other hand, miRNAs are processed from imperfect double-stranded RNAs that can be formed in molecules with self-complementarity. This PhD dissertation is divided in four different parts. In the first part, it is shown that random foldback structures in the genome, once transcribed, could be the source of new MIRNA genes. This scenario complements former theories, which were not sufficient to explain the origin of all new MIRNAs. In the second part of this thesis, the putative non-cell autonomy of miRNAs and trans-acting siRNAs (tasiRNA, a plant-specific class of siRNA) is investigated. By using synthetic molecules, it is shown that miRNAs can produce silencing which spread locally to a limited number of cells, while tasiRNA-triggered silencing is a long-range, cell-to-cell signal. Finally, the third and fourth parts discuss aspects related to the biogenesis of tasiRNAs. The importance and sufficiency of miR173 in starting transitivity is demonstrated and a new mechanism for gene silencing based on this finding is presented.

Sowohl die Entwicklung eines Organismus, als auch seine Reproduktion, seine Reaktionen auf die Umwelt und seine zelluläre Prozesse beruhen auf der korrekten Regulierung seines Genoms. Folglich wurden im Laufe der Evolution verschiedene Strategien zur Kontrolle der Genexpression entwickelt, die von der Verpackung der Chromosomen bis hin zur Stabilität von Proteinen reichen. In Pflanzen sind unter den wichtigsten Regulatoren der Genaktivität die so genannten kleinen RNAs oder small RNAs, bzw. sRNAs. Diese Moleküle werden von dem sogenannten Dicer-like (DCL) Protein aus doppelsträngiger RNA hergestellt und in 19-24 Nukleotid-lange sRNAs prozessiert. Die sRNAs werden dann in einen Effektor-Komplex namens RISC geladen, und verleihen ihm so die Spezifität zur Erkennung bestimmter Nukleinsäuren (Zielsequenzen). Durch sRNAs gesteuerte Genregulation kann sowohl auf der transkriptionellen (transkriptionelles Gene-Silencing, TGS) als auch auf der post-transkriptionellen Ebene (post-transkriptionelles Gene-Silencing, PTGS) auftreten. Während beim TGS einzelne Bausteine der DNA und/oder Histone methyliert werden, werden beim PTGS Zielsequenzen zerstört oder inhibiert und damit die Biosynthese von Proteinen unterbrochen. In Pflanzen werden sRNAs in small interfering RNAs (siRNAs) und Mikro-RNAs (miRNAs) unterteilt. siRNAs werden aus doppelsträngiger RNA hergestellt, die verschiedenartiger Herkunft sein können. miRNAs werden aus RNA Molekülen, die interne Selbst-Komplementarität aufweisen, generiert. Diese Dissertation ist in vier verschiedene Abschnitte unterteilt. Im ersten Teil wird gezeigt, wie Expression von Strukturen mit zufälliger Selbstkomplementarität zu neuen MIRNA Genen führen kann. Diese Beobachtung komplementiert zuvor beschriebene Theorien, die nicht ausreichen um die Herkunft aller endogenen MIRNAs zu erklären, und trägt damit zum Gesamtbild über die Entstehung neuer MIRNAs bei. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Wirkung von miRNAs und trans-acting siRNAs (tasiRNA, eine pflanzenspezifische Klasse von siRNAs) auf ihre Umgebung untersucht. Mit Hilfe von synthetischen Molekülen wird gezeigt, dass miRNAs ein auf wenige Zellschichten lokal begrenztes Gene Silencing initiieren, während tasiRNAs ein wesentlich weitläufigeres Silencing auslösen. Im dritten und vierten Teil werden die verschiedenen Aspekte der Biogenese von tasiRNAs diskutiert. Die Bedeutung und weit reichende Funktion des MIR173 Gen auf die Verstärkung von Gene Silencing, sowie eine neue, darauf basierende Methode für gezieltes Gen-Silencing werden vorgestellt.