Zelluläre Ko-Repressoren als funktionelle Interaktoren des Papillomvirus E8^E2C-Proteins

Abstract

Das E2 Gen von Papillomviren kodiert für mehrere Regulatorproteine, welche die Transkription und Replikation des viralen Genoms kontrollieren und somit die Expression der viralen Onkoproteine (E6/E7) modulieren. Da das E2 Gen häufig durch Integration in das Genom der Wirtszelle in Zervixkarzinomen deletiert ist, wurde postuliert, dass Störungen in der Onkogenexpression zur malignen Progression beitragen könnten. Neben dem vollständigen E2 Protein kodieren mehrere humane Papillomviren (HPV) für ein E8^E2C Protein, das ein potenter Repressor der viralen Transkription und Genomreplikation ist. Das HPV31 E8^E2C Protein besteht aus der E8 Repressordomäne und der E2C Domäne, welche sequenzspezifische Bindung an DNA und Dimerisierung zwischen E2 Proteinen vermittelt. Vorbefunde legten nahe, dass E8^E2C zelluläre Proteine wie Histondeacetylasen rekrutiert und so als Repressor fungiert. Um den Mechanismus der E8^E2C-vermittelten Repression genauer aufzuklären, wurden einerseits ein genetischer Screen in Hefe durchgeführt und andererseits 31E8^E2C und assoziierte Proteine aus humanen Zellen quantitativ immunopräzipitiert. Dadurch konnten das „Chromodomain Helicase DNA binding protein 6“ (CHD6) sowie Komponenten des „nuclear receptor corepressor complex“ (N-CoR) als neue Interaktionspartner identifiziert werden. CHD6 ist Teil eines Multiproteinkomplexes, der vermutlich Transkription reguliert. Die Bindung von CHD6 erfolgte über die E2C Domäne und die des N-CoR Komplex über die E8 Repressordomäne. Beide Interaktionen sind hochkonserviert, da sie auch für die E8^E2C Proteine von HPV16 und 18 nachweisbar waren. Mutationsanalysen der 31E2C Domäne und RNA Interferenz-Experimente belegten, dass die E8^E2C/CHD6 Interaktion zur transkriptionellen Repression des E6/E7 Promoters beiträgt. CHD6 interagiert auch mit 31E2 und dies trägt zur transkriptionellen Repression aber nicht zur Aktivierung durch E2 bei. Mutationsanalysen von 16, 18 und 31E8^E2C belegten, dass die Rekrutierung des N-CoR Komplexes für deren Repressionsaktivität wichtig ist. Ein artifizieller Repressor bestehend aus der KRAB-Domäne des zellulären KOX1 Proteins und der 31E2C Domäne verhielt sich funktionell wie E8^E2C, was nahelegt, dass die Repression des E6/E7 Promotors keine spezifische Eigenschaft viraler Proteine ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die transkriptionelle Repression durch E8^E2C durch die Rekrutierung unterschiedlicher Multiproteinkomplexe sowohl über die E8 Repressordomäne als auch über die E2C-Domäne vermittelt wird.

The papillomavirus E2 gene encodes for several regulatory proteins, which control the transcription and replication of the viral genome and thereby modulate the viral oncogene (E6/E7) expression. Since the E2 open reading frame is often disrupted after integration in the host cell genome in cervical carcinomas it has been postulated that dysfunctions in the oncogene expression contribute to malignant progression. Beside the full length E2 protein several human papillomaviruses encode for the E8^E2C protein which is a potent repressor of the viral transcription and genome replication. The HPV31 E8^E2C protein consists of the E8 repression domain and the E2C domain which mediates sequence specific DNA binding and dimerisation between E2 proteins. Recent results indicate that E8^E2C recruits cellular proteins like e.g. Histone deacetylases, thereby acting as a repressor. To further elucidate the mechanism of the E8^E2C mediated repression, on the one hand a genetic screen in yeast was performed and on the other hand 31E8^E2C associated proteins were quantitavely co-immunoprecipitated out of human cells. Thus the „Chromodomain Helicase DNA binding protein 6“ (CHD6) as well as components of the “nuclear receptor corepressor complex“ (N-CoR could be identified as novel interaction partners. CHD6 is a part of a multi protein complex that regulates transcription. The binding of CHD6 occurred in the E2C domain and the N-Cor binding in the E8 repression domain. Both interactions are highly conserved, since they could be shown with the E8^E2C proteins of HPV16 and 18. Mutational analyses of the E2C domain and RNA interference experiments validated that the E8^E2C/CHD6 interaction contributes to the transcriptional repression of the E6/E7 promotor. CHD6 also interacts with 31E2 and this contributes to transcriptional repression but not to activation by E2. Mutational analyses of HPV16, 18 and 31 E8^E2C confirmed that the recruitment of the N-Cor complex is necessary for their repression activity. An artificial repressor consisting from the KRAB-domain of the cellular KOX1 protein and the 31E2C domain functionally acted like E8^E2C. This suggests that the repression of the E6/E7 promotor is not a unique property of viral proteins. In summary the transcriptional repression by E8^E2C is mediated by the recruitment of different multi protein complexes by the E8 domain as well as by the E2C domain.