Spindle assembly checkpoint-independent functions of Bub1 and Bub3 in fission yeast mitosis

Abstract

To prevent errors in chromosome segregation, chromosomes have to achieve bi-orientation, i.e. the kinetochores of both sister chromatids have to attach to microtubules emanating from opposite spindle poles. The spindle assembly checkpoint (SAC) prevents anaphase onset as long as chromosomes are not correctly bi-oriented. In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe and most other eukaryotic organisms studied, the core proteins of the SAC comprise Bub1, Bub3, Mad1, Mad2, Mad3 and Mph1 (Mps1 in other organisms). These proteins localize to kinetochores in early mitosis and are specifically enriched at malattached kinetochores, which is considered to be required for SAC signaling. The SAC kinase Bub1 has also checkpoint-independent functions. Bub1 is known to recruit Sgo2 (shugoshin) to centromeres, which is required for accurate chromosome segregation. In addition, my genetic data indicated that Bub1 and its binding partner Bub3 share a function that is independent of Sgo2 and the SAC, but is presumably connected to regulation of microtubule dynamics. Bub3 was previously believed to be one of the core proteins of the SAC, but we and others surprisingly found that it is not essential for SAC activity in fission yeast. Furthermore, Sgo2 localization is not completely abolished in bub3D cells, in contrast to bub1D cells. However, cells lacking Bub3 are sensitive to microtubule-destabilizing drugs and delay in unperturbed mitosis, indicating that Bub3 has a function in mitosis. I found that after release from conditions that cause disruption of spindles in early mitosis, bub3D cells show pronounced chromosome missegregation. In cells recovering from spindle disruption, unclustered chromosomes are usually captured by astral microtubules and retrieved to the spindle pole bodies (SPBs), before they get bi-oriented on the spindle. In the absence of Bub3 and in a Bub1 mutant lacking the region required for interaction with Bub3, chromosomes were retrieved but remained mono-oriented close to the SPB for a prolonged period. This defect in bi-orienting chromosomes on the spindle was not observed in cells lacking Sgo2, indicating that Bub1 and Bub3 share a function in bi-orienting chromosomes which is independent of Sgo2. Based on my results, I propose that Bub1 and Bub3 have an influence on microtubule dynamics at the kinetochore and are therefore required for establishing stable kinetochore microtubule attachment. This function is largely dispensable in normal unperturbed mitosis, but becomes essential when chromosome segregation is challenged under certain growth conditions or in a specific genetic background. Even though Bub3 is not essential for SAC activity in fission yeast, it is nevertheless required for kinetochore localization of Mad1, Mad2, Bub1 and Mad3, indicating that – in contrast to the current model - enrichment of these proteins at unattached kinetochores is not essential for SAC signaling. This raises the questions of how the SAC signal is generated at the kinetochore, which I am currently still investigating and for which I present initial results here. As the checkpoint kinase Mph1 seems to localize even in the absence of Bub3, it is likely to be the key player at the kinetochore.

Um Fehler bei der Chromosomensegregation zu vermeiden, müssen Chromosomen bi-orientiert werden, d. h. die Kinetochore beider Schwesterchromatiden müssen mit Mikrotubuli verknüpft werden, die von den entgegengesetzten Spindelpolen ausgehen. So lange die Chromosomen noch nicht korrekt bi-orientiert sind, wird das Einsetzen der Anaphase durch den ‘Spindle Assembly Checkpoint’ (SAC) verhindert. Bei der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe und anderen untersuchten, eukaryotischen Organismen sind Bub1, Bub3, Mad1, Mad2, Mad3 and Mph1 (Mps1 in anderen Organismen) die zentralen Proteine des SACs. Diese Proteine lokalisieren in der frühen Mitose am Kinetochor und sind speziell an falsch an Mikrotubuli angebunden Kinetochoren angereichert, was als Voraussetzung für die Entstehung des SAC-Signals gesehen wird. Die SAC-Kinase Bub1 hat zusätzlich Checkpoint-unabhängige Funktionen. Bub1 rekrutiert bekanntermaßen Sgo2 (shugoshin) zu den Zentromeren, was für akkurate Chromosomensegregation notwendig ist. Außerdem deuten meine Ergebnisse darauf hin, dass sich Bub1 mit seinem Interaktionspartner Bub3 eine Aufgabe teilt, die unabhängig von Sgo2 und dem SAC ist, aber vermutlich mit der Regulation der Mikrotubulidynamik zu tun hat. Man glaubte bislang, dass Bub3 eine Hauptkomponente des SACs ist. Überraschenderweise fanden wir und andere Forschungsgruppen jedoch heraus, dass Bub3 in der Spalthefe nicht essentiell für SAC-Aktivität ist. Zudem war die Lokalisation von Sgo2 in bub3D-Zellen, im Gegensatz zu bub1D-Zellen, nicht komplett verhindert. Dennoch sind Zellen ohne Bub3 empfindlich gegenüber Mikrotubuli-destabilisierenden Substanzen und verbleiben länger in der Mitose, was darauf hindeutet, dass Bub3 andere mitotische Funktionen aufweist. Ich konnte zeigen, dass Missegregation von Chromosomen vermehrt auftritt, nachdem bub3D-Zellen aus Bedingungen entlassen wurden, die Spindelbildung in der frühen Mitose verhindern. In Zellen, die sich von solchen Bedingungen erholen, werden freie Chromosomen von astralen Mikrotubuli aufgegriffen und zurück zum Spindelpol transportiert, bevor sie auf der Spindel bi-orientiert werden. In Abwesenheit von Bub3 und in Bub1-Mutanten, die nicht mit Bub3 interagieren können, werden Chromosomen zwar zum Spindelpol zurückgebracht, aber dort verbleiben sie über längere Zeit in einem mono-orientierten Zustand. Dieser Defekt in der Bi-orientierung der Chromosomen auf der Spindel konnte in Zellen ohne Sgo2 nicht beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass Bub1 und Bub3 unabhängig von Sgo2 eine Funktion in der Bi-orientierung der Chromosomen aufweisen. Basierend auf meinen Ergebnissen stelle ich die Vermutung auf, dass Bub1 and Bub3 die Mikrotubulidynamik am Kinetochor beeinflussen und daher für die Entstehung stabiler Kinetochore-Mikrotubuli-Verknüpfungen benötigt werden. Diese Funktion ist unter normalen Umständen in der Mitose nicht essentiell. Sie ist jedoch unabkömmlich wenn die Chromosomensegregation unter bestimmten Wachstumsbedingungen oder in einem spezifischen genetischen Hintergrund beeinträchtigt ist. Obwohl Bub3 in der Spalthefe nicht essentiell für SAC-Aktivität ist, wird es trotzdem für die Kinetochor-Lokalisation von Mad1, Mad2, Bub1 und Mad3 benötigt, was darauf hindeutet, dass die Anreicherung dieser Proteine am Kinetochor – im Widerspruch zur derzeitig akzeptierten Modellvorstellung – nicht essentiell für das SAC-Signal ist. Das wirft die Frage auf, wie das SAC-Signal am Kinetochor entsteht. Diesen Aspekt untersuche ich im Moment und präsentiere erste Ergebnisse in dieser Arbeit. Da die Checkpoint-Kinase Mph1 auch in Abwesenheit von Bub3 noch am Kinetochor zu lokalisieren scheint, ist es wahrscheinlich, dass sie die Hauptaufgabe in der Bildung des SAC-Signals am Kinetochor übernimmt.