Inhaltszusammenfassung:
Die Dimethylallyltryptophansynthase (DMATS) katalysiert den ersten Schritt der Ergotalkaloid-Biosynthese und prenyliert dabei L-Trp am C-4 des Indolrings mit Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP) als Prenyldonor. Eine Vielzahl von Orthologen der DMATS wurde in Genomen von verschiedenen Pilzen nachgewiesen, aber von keinem der von diesen Genen codierten Enzyme konnte in der Vergangenheit die 3D Struktur ermittelt werden. Nun konnte zum ersten Mal die Röntgenstruktur einer DMATS aufgeklärt werden. Die Struktur von FgaPT2, der DMATS aus Aspergillus fumigatus, wurde mit einer Auflösung von 1,76 Å bestimmt. Die Kristallform gehört zur Raumgruppe P212121 und enthält zwei Moleküle in der asymmetrischen Einheit. Die 3D Struktur zeigt eine aus alpha,beta-Einheiten bestehende barrel-Struktur, die kürzlich erstmals in einem bakteriellen Enzym (NphB) entdeckt und Prenyltransferase (PT)-barrel genannt wurde. Obwohl NphB auch die Prenylierung eines aromatischen Substrats katalysiert, besitzt FgaPT2 zu diesem Enzym keine Sequenzähnlichkeit. Die Struktur von FgaPT2 mit dem gebundenen Substrat L-Trp und dem gebundenen nicht-hydrolysierbaren Substratanalogon DMASPP konnte mit einer Auflösung von 2,2 Å ermittelt werden. Auf der Grundlage dieser Struktur wurde ein Modell zur Beschreibung einer enzymatisch katalysierten Friedel-Crafts-Alkylierung entwickelt, das auch Erklärungen für die strenge Regiospezifität der DMATS-Reaktion am C-4 und die ungewöhnliche Mg2+-Unabhängigkeit des Enzyms liefert. Die Funktion einzelner Aminosäuren wurde herausgearbeitet und ein detaillierter Reaktionsmechanismus vorgeschlagen.
Die Prenyltransferase CloQ aus Streptomyces roseochromogenes katalysiert eine ähnliche Reaktion wie FgaPT2 und zeigt ähnliche biochemische Eigenschaften, aber keine Sequenzähnlichkeit zu FgaPT2. CloQ katalysiert die Prenylierung von 4-Hydroxyphenylpyruvat (4-HPP) mit DMAPP als Prenyldonor in der Biosynthese des Antibiotikums Clorobiocin. Es wurden vier Strukturen von CloQ gelöst: CloQ mit gebundenem 4-HPP (2,5 Å), CloQ ohne Substrat (3,1 Å), CloQ mit der Mutation C215S (1,9 Å) und CloQ mit der Mutation R66S und gebundenem 4-HPP (2,2 Å). Alle Kristallformen gehören zur Raumgruppe I4122. Die Raumstruktur von CloQ entspricht dem oben genannten PT-barrel. Trotz intensiver Versuche gelang es nicht, das isoprenoide Substrat DMAPP in der Struktur zu zeigen. Jedoch konnte durch Sequenz- und Strukturvergleiche mit FgaPT2 und NphB eine hypothetische Bindestelle von DMAPP vorgeschlagen und durch Mutationsexperimente verifiziert werden.
Die in der Röntgenstruktur eindeutig erkennbare kovalente Bindung des aromatischen Substrats mit C215 in Form einer Thiohemiketalbindung ist für die katalytische Reaktion nicht relevant, was ebenfalls durch Mutationen belegt wurde. Durch Vergleich der CloQ-Struktur mit den Strukturen von FgaPT2 und NphB konnte die Funktion mehrerer Aminosäuren in CloQ definiert und durch Mutationsexperimente bestätigt werden. Ein Reaktionsmechanismus, der ähnlich verläuft wie bei FgaPT2, konnte dadurch vorgeschlagen werden.
Die in der Literatur diskutierte Promiskuität der aromatischen Prenyltransferasen wurde auch für CloQ durch Umsetzung der artifiziellen Substrate L-Tyr (Km = 680 my M), p-Cumarsäure (Km = 874 my M) und Geranylpyrophosphat (Km = 307 my M) beobachtet. Die kinetischen Parameter von CloQ mit den genuinen Substraten zeigen jedoch ganz klar eine Präferenz für die genuinen Substrate (Km 4-HPP = 16 my M, Km DMAPP = 25 my M). Die katalytische Effizienz für deren Umsetzung ist im Vergleich zu den artifiziellen Substraten 1000-mal höher.
Die Amidsynthetase NovL, ein Schlüsselenzym der Biosynthese des Antibiotikums Novobiocin, katalysiert sowohl die Aktivierung seines Säuresubstrats durch eine Adenylierung als auch den anschließenden Acyltransfer auf die Aminogruppe des Aminocoumarinrings. NovL wurde kristallisiert und ein Datensatz mit einer Auflösung von 2,6 Å aufgenommen. Die Bestimmung der Proteinphasen war aufgrund der Zwillingsbildung der Kristalle jedoch bislang nicht möglich. Parallel zur strukturbiologischen Untersuchung von NovL wurden biochemische Untersuchungen an den Amidsynthetasen NovL und CouL durchgeführt. Zur Untersuchung der für die Substraterkennung verantwortlichen Sequenzbereiche wurden zehn verschiedene Chimäre aus diesen Enzymen hergestellt und deren Aktivität mit den genuinen Substraten (3-Dimethylallyl-4-hydroxybenzoes?ure und 3-Methylpyrrol-2,4-dicarbonsäure) und einem artifiziellen Substrat (3-Propyl-4-hydroxybenzoesäure) untersucht. Die für die Substraterkennung verantwortlichen Bereiche liegen bei NovL (CouL) zwischen den Aminosäuren 215 bis 412 (217 bis 414). Dies wird auch durch einen Sequenzvergleich der beiden Amidsynthetasen mit zwei Adenylierungsdomänen (DhbE und PheA) von nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen gestützt. Mit Hilfe der Sequenzvergleiche können einzelne Aminosäuren vorgeschlagen werden, die wahrscheinlich von besonderer Bedeutung für die Substratspezifität sind.
Abstract:
The dimethylallyl tryptophan synthase (DMATS) catalyzes the first committed step of ergot alkaloid biosynthesis, i.e. the prenylation of L-tryptophan at C-4 of the indole moiety with the isoprenoid substrate dimethylallyl diphosphate. Orthologs of DMATS are found in many fungal genomes, but no 3D structure of these enzymes has been determined yet. In this thesis the first x-ray structure of a DMATS is presented. The structure of FgaPT2, the DMATS from Aspergillus fumigatus, was determined at a resolution of 1.76 Å. The crystals belong to the space group P212121 and contain two molecules in the asymmetric unit. The 3D structure belongs to a rare beta/alpha barrel fold, called prenyltransferase (PT) barrel, which was recently discovered in the bacterial enzyme NphB. NphB also catalyzes the prenylation of an aromatic substrate but does not show detectable primary sequence similarity to DMATS. The structure of FgaPT2 complexed with the substrate L-tryptophan and with the non hydrolysable DMAPP-analogue DMASPP was determined to a resolution of 2.2 Å. On basis of the structure a detailed reaction mechanism was suggested for this enzyme-catalyzed Friedel-Crafts-alkylation which explains the strict regiospecificity of the DMATS reaction for prenylation at C-4 and the unusual independence of Mg2+. The function of several residues was investigated by site-directed mutagenesis.
The prenyltransferase CloQ from the clorobiocin biosynthetic pathway of Streptomyces roseochromogenes catalyzes, like FgaPT2, a prenylation of an aromatic substrate. The two enzymes show similar biochemical properties but do not show detectable primary sequence similarity. CloQ catalyzes the attachment of a dimethylallyl moiety to 4-hydroxyphenylpyruvate (4-HPP). The structure of wild-type CloQ, with 4-HPP bound, was determined at 2.2 Å resolution. Three further structures were determined, the wild-type protein in the absence of substrates (3.1 Å), the C215S mutant (1.9 Å) and the R66S mutant, with 4-HPP bound (2.2 Å). All crystals belong to the space group I4122. The CloQ structure also shows the PT barrel fold mentioned above. Despite exhaustive attempts it was not possible to obtain a structure of CloQ complexed with the isoprenoid substrate DMAPP. A structure-based sequence alignment and superpositions of CloQ with the ligand-bound structures of NphB and FgaPT2 resulted in a plausible model of the binding site of DMAPP. This was confirmed by site-directed mutagenesis.
4-HPP forms a covalent link to C215 to give a thiohemiketal, what is evidenced by the continuous electron density between the protein and the ligand. However, site-directed mutagenesis experiments showed that this bond is not relevant for catalytic activity. By superposition of CloQ with the ligand-bound structures of NphB and FgaPT2, a hypothesis for the function of several amino acid residues in CloQ was generated and verified by site-directed mutagenesis. A reaction mechanism similar to FgaPT2 was suggested.
The previously described promiscuity of the aromatic prenyltransferases was also confirmed for CloQ with the artificial substrates L-tyrosine (Km = 680 my M), p-coumaric acid (Km = 874 my M), and geranyl pyrophosphate (Km = 307 my M). However, the determination of the kinetic parameters of the genuine substrates demonstrated a clear preference of CloQ to the genuine substrates (Km 4-HPP = 16 my M, Km DMAPP = 25 my M). The catalytic efficiency for the genuine substrate is 1000 fold higher than for the artificial substrates.
The amide synthetase NovL is a key enzyme of the biosynthesis of the antibiotic novobiocin. NovL catalyzes the activation of its acyl substrate as acyl adenylate and the subsequent transfer of the acyl group to the amino group of the aminocoumarin ring. In this thesis, NovL was crystallized and a data set was collected to a resolution of 2.6 Å. Due to the twinning of the NovL crystals, the protein phases could not be determined yet. In addition to the structural investigation of NovL, NovL and the amide synthetase CouL were biochemically investigated. Ten different chimera of NovL and CouL were generated, the activity was determined with the genuine substrates (3-dimethylallyl-4-hydroxybenzoic acid and 3-methylpyrrole-2,4-dicarboxylic acid) and with one artificial substrate (3-propyl-4-hydroxybenzoic acid) to investigate the relevance of several regions of the amino acid sequences for substrate recognition. The important amino acids for substrate recognition are located in NovL (CouL) in the region comprising amino acids 215 to 412 (217 to 414). This was confirmed by the sequence alignment of both amide synthetases with two adenylation domains (DhbE and PheA) of nonribosomal peptide synthetases. Due to this alignment several amino acids were suggested to play an important role in substrate recognition.
Crystal structure , PT fold , ABBA prenyltransferase , Ergot alkaloids , Aminocoumarin antibiotics