A functional analysis of the Nup188-Nup93 complex in the Nuclear Pore Complex

Abstract

The determining property of eukaryotes is the compartmentalization of genetic information inside the cell nucleus. This compartmentalization by the nuclear envelope (NE) enables the eukaryotic cell to separate transcription and translation in space and time. The NE is composed of two membranes, the outer (ONM) and inner nuclear membrane (INM). The ONM is an extension of the endoplasmic reticulum whereas the INM contacts chromatin and the nuclear lamina, and is connected to the ONM via the pore membrane, the region where nuclear pore complexes (NPCs) are localized. Although, these membranes are continuous with each other, the INM contains a distinct set of proteins and the mechanism of INM protein targeting is not yet completely understood. NPCs are the gateway to the nucleus; they are embedded on the NE where INM and ONM are fused. They are about 60 MDa in vertebrates, and, are comprised of around 30 distinct proteins called nucleoporins or nups many which nucleoporins form subcomplexes that act as building blocks for NPC assembly.

This thesis aims to characterize the Nup188-Nup93 complex during NPC assembly and function. One of the evolutionarily conserved subcomplexes is the Nup93 complex. It is a major structural component of the NPC which is thought to be positioned at the region where the NPC and nuclear membranes interact. In Xenopus, the core of the Nup93 complex has been understood to be formed by three proteins: Nup205, Nup188 and Nup93. Using biochemical and cell biological assays we show that Nup93 is not part of a single complex but is in fact a component of two distinct subcomplexes, Nup188-Nup93 and Nup205-Nup93. Using in vitro nuclear assembly reactions, we find that neither Nup188-Nup93 nor Nup205-Nup93 is required for NPC or NE formation at the end of mitosis. However, nuclei lacking Nup188-Nup93 increased dramatically in size compared to normal nuclei. Our analysis of Nup188-Nup93 depleted nuclei demonstrates that the DNA content and nucleocytoplasmic transport of soluble proteins, mRNA and small molecules are similar to normal nuclei. We show, through a novel assay, that the enlarged nuclear phenotype observed in the absence of Nup188-Nup93 correlates with an increase in translocation of integral membrane proteins to the INM through NPCs. The phenotype is rescued with recombinant Nup188-Nup93 confirming the specificity of the depletion effect. This work establishes the idea that Nup188-Nup93 limits the passage of membrane proteins through the NPC and is thus crucial for the homeostasis of nuclear membranes. In addition, our results also strengthen the view that integral membrane proteins of INM reach to the interior of nuclei by passage from the ONM through the NPC in the plane of membrane.

Ein zentrales Charakteristikum in Eukaryonten ist die Kompartimentierung der Erbinformation im Zellkern. Diese Kompartimentierung durch die Kernhülle erlaubt es der eukaryontischen Zelle, Transkription und Translation räumlich und zeitlich voneinander zu trennen. Die Kernhülle besteht aus zwei Membranen, der äußeren und inneren Kernmembran. Die äußere Kernmembran ist ein Ausläufer des endoplasmatischen Reticulums, wohingegen die innere Kernmembran mit Chromatin und der Kernlamina verknüpft ist und mit der äußeren Kernmembran über die Porenmembran, die Region, an der Kernporenkomplexe sitzen, verbunden ist. Obwohl alle diese Membranen miteinander verbunden sind, besitzt die innere Kernmembran eine spezifische Proteinzusammensetzung, wobei noch nicht vollständig verstanden ist, wie diese Proteine dorthin gelangen. Der Zugang zum Zellkern wird durch Kernporenkomplexe ermöglicht. Diese sind an den Punkten, wo die innere mit der äußeren Kernmembran verbunden ist, in die Kernhülle eingebettet. In Vertebraten haben Kernporenkomplexe eine Masse von ca. 60 MDa und sind aus rund 30 verschiedenen Proteinen, sogenannten Nukleoporinen oder Nups, aufgebaut. Viele dieser Nukleoporine sind Teile größerer Unterkomplexe, die die Bausteine für den Aufbau der Kernporenkomplexe bilden.

Diese Arbeit hat zum Ziel, die Bedeutung des Nup188-Nup93-Komplexes für den Aufbau und die Funktion des Kernporenkomplexes zu charakterisieren. Einer der evoluntionär konservierten Unterkomplexe ist der Nup93-Komplex. Er stellt eine bedeutende strukturelle Einheit der Kernpore dar, von der man annimmt, dass sie an der Interaktionsfläche von Kernpore und Kernmembranen lokalisiert ist. In Xenopus ging man ursprünglich davon aus, dass die drei Proteine Nup205, Nup188 und Nup93 die Grundeinheit dieses Komplexes bilden. Mittels biochemischer und zellbiologischer Versuche wird hier gezeigt, dass Nup93 nicht nur Teil eines Komplexes, sondern Bestandteil von zwei verschiedenen Unterkomplexen, Nup188-Nup93 und Nup205-Nup93, ist. Mithilfe von in vitro Reaktionen zum Kernaufbau wird hier nachgewiesen, dass weder Nup188-Nup93 noch Nup205-Nup93 für den Aufbau von Kernporen und der Kernhülle am Ende der Mitose notwendig sind. Allerdings werden Kerne, denen Nup188-Nup93 fehlt, um ein vielfaches größer als normale Zellkerne. Unsere Analyse der Nup188-Nup93 depletierten Zellkerne zeigt, dass der DNA-Gehalt sowie der Transport von löslichen Proteinen, mRNA und kleinen Molekülen zwischen Zytosol und Kerninnerem im Vergleich zu Kontrollkernen unverändert bleiben. Mittels eines neuen Versuchssystems wird gezeigt, dass der Phenotyp der vergrösserten Kerne mit einen erhöhten Durchtritt von integralen Membraneproteinen durch die Kernpore zur inneren Kernmembran korreliert. Dieser Phänotyp kann durch die Zugabe von rekombinanten Nup188-Nup93 aufgehoben werden, was die Spezifität der Depletion unterstreicht. Diese Arbeit belegt, dass Nup188-Nup93 den Durchgang von Membranproteinen durch die Kernpore begrenzt und damit maßgeblich für die Homöostase der Kernmembranen ist. Die Ergebnisse untermauern außerdem die Annahme, dass integrale Membranproteine der inneren Kernmembran diese mittels Transport entlang der äußeren Kernmembran und den Durchtritt durch die Kernpore in der Membranebene erreichen.