Biosynthesis of liponucleoside antibiotics in Streptomyces : Molecular and biochemical investigations of the caprazamycin and the liposidomycin gene cluster

Abstract

Caprazamycins are potent anti-mycobacterial liponucleoside antibiotics isolated from Streptomyces sp. MK730-62F2 and belong to the translocase I inhibitor family. Their complex structure is derived from 5’-(O-aminoribosyl)-glycyluridine and comprises a unique N-methyl-diazepanone ring. The first part of the presented thesis describes the identification of the caprazamycin biosynthetic gene cluster, representing the first identified gene cluster of a translocase I inhibitor. Sequence analysis revealed the presence of 23 open reading frames putatively involved in export, resistance, regulation and biosynthesis of the caprazamycins. Heterologous expression of the gene cluster in Streptomyces coelicolor M512 led to the production of non-glycosylated bioactive caprazamycin derivatives. A set of gene deletions validated the boundaries of the cluster. In the following part of the thesis inactivation of cpz21 resulted in the accumulation of novel simplified liponucleoside antibiotics which lack the 3-methylglutaryl moiety. Cpz21 was therefore assigned to act as an acyltransferase, responsible for the attachment of methylglutarate in caprazamycin biosynthesis. On cosmid cpzLK09 which harbours the caprazamycin gene cluster the genes for the formation of dTDP-L-rhamnose could not be identified. However, co-expression of cpzLK09 in S. coelicolor M512 with plasmid pRHAM, containing all required genes for dTDP-L-rhamnose biosynthesis, led to the production of intact caprazamycins. In vitro studies showed that Cpz31 is responsible for the attachment of the L-rhamnose to the caprazamycin aglycones, generating a rare acylated deoxyhexose. An L-rhamnose gene cluster was identified elsewhere on the Streptomyces sp. MK730-62F2 genome. The L-rhamnose subcluster was assembled to cpzLK09 using Red/ET-mediated recombination. Heterologous expression of the resulting cosmid led to the production of caprazamycins, demonstrating that both set of genes are required for caprazamycin biosynthesis. The liposidomycins are potent inhibitors of the bacterial translocase I and differ from the caprazamycins only in the absence of the permethylated L-rhamnose and the presence of a sulfate group at the aminoribosyl moiety. In the next part of the thesis the liposidomycin biosynthetic gene cluster was identified in Streptomyces sp. SN-1061M using cpz11, a putative N-methyltransferase from the caprazamycin gene cluster, as a probe. Heterologous expression of the identified cosmid in Streptomyces coelicolor M512 led to the production of liposidomycins. A comparison of the liposidomycin gene cluster and the caprazamycin gene cluster revealed strong similarities in both clusters though other parts reflect the structural differences of the two compounds. A set of genes were assigned to be involved in the characteristic sulfation reaction of the liposidomycins, including a putative sulfotransferase gene. Surprisingly, similar genes were found adjacent to the caprazamycin gene cluster in Streptomyces sp. MK630-62F2. Reinvestigation of extracts from both, Streptomyces sp. MK630-62F2 and the heterologous caprazamycin producer S. coelicolor M512/cpzLK09 led to the identification of novel sulfated caprazamycin derivatives. The last part of the thesis demonstrates that Cpz4 from Streptomyces sp. MK730-62F2 is an arylsulfate sulfotransferase (ASST) responsible for the formation of sulfated liponucleoside antibiotics. Gene deletion mutants showed that cpz4 is required for the production of sulfated caprazamycin derivatives. Cloning, overproduction and purification of Cpz4 resulted in a 58 kDa soluble protein. The enzyme catalyzed the transfer of a sulfate group from p-nitrophenol sulfate (pNS; Km 48.1 µM, kcat 0.14 s-1) and methylumbelliferone sulfate (MUS; Km 34.5 µM, kcat 0.15 s-1) onto phenol (Km 25.9 mM and 29.7 mM, respectively). The Cpz4 reaction proceeds by a ping pong bi-bi mechanism. Several synthetic structural analogs of intermediates of the caprazamycin biosynthetic pathway were tested as substrates of Cpz4. Des-N-methyl-acyl-caprazol was converted with highest efficiency 100 times faster than phenol. The fatty acyl side chain and the uridyl moiety seem to be important for substrate recognition by Cpz4. Liponucleosides, partially purified from various mutant strains, were readily sulfated by Cpz4 using pNS. No product formation could be observed with PAPS as the donor substrate. Sequence homology of Cpz4 to the previously examined ASSTs is low. However, numerous orthologs are encoded in microbial genomes and represent interesting subjects for future investigations. In vivo, in vitro and in silico analysis of the caprazamycin and the liposidomycins biosynthetic gene clusters conducted in this thesis allowed a first proposal of the biosynthetic pathway to the liponucleosides and provides insights into the formation of related uridyl-antibiotics.

Caprazamycine sind Liponukleosid-Antibiotika die aus Streptomyces sp. MK730-62F2 isoliert wurden und den Translokase I-Inhibitoren zugerechnet werden. Sie weisen eine sehr gute Wirksamkeit gegen Mykobakterien und anderen Gram-positiven Mikroorganismen auf. Die Caprazamycine besitzen eine hochkomplexe chemische Struktur, bestehend aus einem 5’-(O-Aminoribosyl)-Glycyluridin und einem N-Methyl-Diazepanonring. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Identifizierung des Caprazamycin-Genclusters beschrieben; des ersten identifizierten Biosynthese-Genclusters eines Translokase I-Inhibitors. Die Sequenzanalyse ergab, dass 23 mögliche Gene auf dem Cluster am Export, der Resistenz, der Regulation und an der Biosynthese der Caprazamycine beteiligt sind. Die heterologe Expression des Clusters in Streptomyces coelicolor M512 führte zur Produktion nicht-glykosylierter Caprazamycin-Derivate. Durch verschiedene Deletions-Experimenten konnten die Grenzen des Clusters bestimmt werden. Im nächsten Teil der Arbeit wird gezeigt, dass durch die Inaktivierung von cpz21 nur noch die Hydroxyacyl-Caprazole produziert werden. Diesen neuen Substanzen weisen sie Bioaktivität gegen Mykobakterien auf und stellen damit strukturell vereinfachte Liponukleosid-Antibiotika dar. Auf dem Cosmid cpzLK09, welches das Caprazamycin-Gencluster trägt, konnten keine Gene identifiziert werden die für die Biosynthese der benötigten dTDP-L-Rhamnose zuständig sein könnten. Durch die Co-Expression von cpzLK09 mit dem Plasmid pRHAM, das die ensprechenden Gene zur Herstellung von dTDP-L-Rhamnose trägt, wurden die glykosilierten Caprazamycine im heterologen Stamm S. coelicolor M512 akkumuliert. In vitro-Experimente zeigten, dass Cpz31 für den Transfer der Desoxyzucker-Einheit zuständig ist. Im Caprazamycin-Produzenten Streptomyces sp. MK730-62F2 konnten daraufhin die fehlenden Gene für die Biosynthese der dTDP-L-Rhamnose auf einem separaten Gencluster identifiziert werden. Die Vereinigung und Expression des neu gefundenen Clusters mit dem Caprazamycin-Gencluster führte zur heterologen Produktion der glykosilierten Caprazamycine. Die Liposidomycine sind mit den Caprazamycinen strukturell verwandte Translokase I-Inhibitoren. Sie unterscheiden sich von Caprazamycinen durch die sulfatierte Aminoribose-Gruppe und durch die Abwesenheit der Desoxyzucker-Einheit. In diesem Teil der Arbeit wird die Identifizierung des Liposidomycin-Genclusters aus Streptomyces sp. SN-1061M beschrieben. Heterologe Expression des Genclusters in S. coelicolor M512 erlaubte die Produktion der Liposidomycine. Ein Vergleich mit dem Caprazamycin-Gencluster zeigte starke Ähnlichkeiten, aber auch Unterschiede, entsprechend der strukturellen Besonderheiten beider Liponukleosid-Antibiotika. Eine Reihe von Genen wurde der Sulfatierungsreaktion in der Liposidomycin-Biosynthese zugeordnet. Interessanterweise, wurden ähnliche Gene auch nahe des Caprazamycin-Genclusters gefunden. Die daraufhin durchgeführte Untersuchung der Caprazamycin-Produzenten Streptomyces sp. MK730-62F2 und S. coelicolor M512/cpzLK09 zeigte dass in den Extrakten beider Stämme sulfatierte Caprazamycin-Derivate zu finden waren. Im letzten Teil der Arbeit wird gezeigt, dass es sich bei dem Enzym Cpz4 aus Streptomyces sp. MK730-62F2 um eine neuartige Arylsulfatsulfotransferase (ASST) handelt, welches die Sulfatierung von Liponukleosid-Antibiotika katalysiert. Die Untersuchung von Deletionsmutanten zeigte, dass cpz4 für die Produktion sulfatierter Caprazamycin-Derivate essentiell ist. Cpz4 wurde kloniert, heterolog überproduziert und als 58-kDa großes lösliches Protein aufgereinigt. Das Enzym katalysiert den Transfer einer Sulfatgruppe von p-Nitrophenol (pNS; Km 48.1 µM, kcat 0.14 s-1) bzw. Methylumbelliferonsulfat (MUS; Km 34.5 µM, kcat 0.15 s-1) auf Phenol (Km 25.9 mM bzw. 29.7 mM) mittels eines Ping-Pong Reaktionsmechanismus. Die Untersuchung verschiedener synthetisch hergestellter Strukturanaloga von Intermediaten der Caprazamycin-Biosynthese ergab, dass Des-N-Methyl-Acyl-Caprazol von Cpz4 100fach besser umgesetzt wird als Phenol. Der Fettsäure-Rest und die Uridyl-Einheit der Caprazamycin-Derivate scheinen wichtig zu sein für die Substraterkennung durch Cpz4. Die von bakteriellen Mutantenstämmen akkumulierten und partiell aufgereinigten Liponukleosid-Antibiotika wurden in Anwesenheit von pNS als Substratgruppen-Donor ebenfalls von Cpz4 sulfatiert. Kein Umsatz wurde hingegen mit PAPS als Sulfatgruppen-Donor beobachtet. Während die bisher bekannten Arylsulfatsulfotransferasen nur geringe Sequenzhomologie zu Cpz4 aufweisen, scheinen etliche Cpz4-orthologe Proteine in Genomen verschiedenster Mikroorganismen kodiert zu sein. Die in dieser Arbeit vorgestellte in vivo-, in vitro- und in silico-Analyse der Caprazamycin- und Liposidomycin-Gencluster ermöglichte es ein erstes Model zur Biosynthese der Liponukleosid-Antibiotika vorzuschlagen.