The PXR/CAR nuclear receptor sytem and antimalaria chemotherapy

Abstract

Malaria is one of the oldest diseases know to mankind, still having devastating consequences; killing 1 million people/year. The efforts to control this disease have been focused on the control of its transmission and, most importantly, its clinical management by effective chemotherapy. Concerning the latter, several antimalarials have been developed in the last decades. They can be subdivided into four structural classes: aminoquinolines, antifolates, artemisinin derived compounds and naphtoquinones. Although reasonably well studied in pharmacokinetics aspects, very few data is available concerning their effects in the gene expression regulation system. This is particularly relevant concerning the xenosensors PXR and CAR. In a first part, this project aimed to elucidate the capacity of currently used antimalarials and their main known metabolites to activate the PXR/CAR system. For this purpose, mammalian two hybrid and gene reporter assays, together with induction studies in primary human hepatocytes were performed. For PXR and CAR we could observe activation, by compounds from the artemisinin family (artemisinin, arteether, artemeether, deoxy-arteether and deoxy-artemisinin) both in vitro and in primary human hepatocytes, corroborated by the induction of prototypical target genes. A repression by artesunate of key targets genes, CYP3A4 and CYP2B6 was observed by this compound in primary hepatocytes, confirming the observed inhibition in vitro of the induction of both PXR and CAR. Further activation of PXR by the aminoquinolines, lumefantrine, carboximefloquine, amodiaquine, DEAQ and chloroquine, was observed in the in vitro system. Amodiaquine also induced CAR in the in vitro system. From the aforementioned compounds only carboximefloquine, consistently induced the induction of CYP2B6 in the hepatocytes, indicating a promoter specific activity. Both amodiaquine and DEAQ showed a repression of CYP3A4 and CYP2B6, indicating that although they may induce the interaction of PXR with its co-activators, they may not be able to induce the release of co-repressors. The present data is of particular interest regarding the pivotal role of artemisinins and aminoquinolines in the current worldwide WHO supported artemisinin combination therapies (ACT), the first line treatment currently recommended. Future evidence based developments of this therapy can benefit from this data on the high probability of induction of this two gene expression systems by ACT components, and its drug-drug interactions. The second part of this project focused on the study of the genetic basis of variability of PXR dependent induction of key CYP450 upon exposure to artemisinins. The project was based on a previously study in 75 Vietnamese subject (Asimus et al., 2007), where metabolic ratios for a number of pivotal PXR/CAR inducible CYPs (e.g. CYP3A4, CYP2C19) were determined upon artemisinin compounds exposure. For this purpose the promoter region, exons and exon-intron boundaries of the PXR gene were re-sequenced for every subject. This approach allowed the identification of 32 SNPs, six of them described for the first time. Overall, we could observed an increased prevalence of the minor allele for the polymorphisms 252 /275 A>G and 10331 A>G, 10483 T>C in the group of higher inducers. Further analysis of these SNPs in primary human hepatocytes showed a higher CYP3A4 mRNA induction in the carriers of the wt/wt genotype. This is an indication that different distribution of the allele in the high and low inducers group is not influencing directly the expression of CYP3A4. Taken together we could confirm some of the data published concerning phenotypic changes induced by PXR SNPs. However no clear results were obtained for the newly identified SNPs due to a reduced number of samples, except for the SNP F420Y.

Malaria ist eine der ältesten Krankheiten der Menschheit, mit immer noch verheerenden Folgen; jedes Jahr sterben an ihr weltweit 1 Million Menschen. Die Anstrengungen zur Bekämpfung der Krankheit konzentrieren sich zum einen auf die Unterbindung ihrer Übertragung und zum anderen auf eine effektive Arzneimitteltherapie. Zahlreiche Malariatherapeutika wurden in den letzten Jahrzehnten entwickelt. Sie werden in vier strukturelle Klassen unterteilt: Aminochinoline, Antifolate, Artemisinin-Derivate und Naphtochinones. Während pharmakokinetische Aspekte der Malariatherapie vergleichsweise gut untersucht sind, ist nur wenig darüber bekannt, inwieweit diese Arzneimittel die Regulation der Genexpression arzneimittelabbauender Enzyme und von Arzneimitteltransportern beeinflußen. Dies ist insbesondere hinsichtlich der Aktivierung der Fremdstoffsensoren PXR und CAR, welche die Induktion dieser Enzyme und Transporter vermitteln, von Interesse. In ersten Teil dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob die zurzeit eingesetzten Antimalariatherapeutika und ihre wichtigsten Metabolite die Fremdstoffsensoren PXR und CAR aktivieren. Zu diesem Zweck wurden „mammalian two-hybrid“ und Reportergen-Studien durchgeführt. Desweiteren wurde untersucht, ob diese Substanzen die Expression arzneimittelabbauender Enzyme und Transporter in primären, menschlichen Hepatozyten induzieren. Für die meisten Substanzen aus der Artemisinin-Familie (Artemisinin, Arteether, Artemether, Deoxyarteether und Deoxyartemisinin) konnte eine Aktivierung von PXR und CAR in vitro beobachtet werden. Diese Befunde wurden durch die Induktion prototypischer Zielgene von PXR und CAR in mit diesen Substanzen behandelten primären Hepatozyten bestätigt. Im Gegensatz hierzu reprimiert Artesunat die Expression wichtiger Zielgene, wie CYP3A4 und CYP2B6, in primären Hepatozten, welches die in vitro beobachtete Hemmung der Aktivierung von PXR und CAR bestätigt. Weiterhin aktivierten die Aminochinoline Lumefantrin, Carboximefloquin, Amodiaquin, DEAQ und Chloroquin PXR im in vitro System. Amodiaquin aktivierte zusätzlich CAR. Von den genannten Substanzen induzierte nur Carboxymefloquin die Expression von CYP2B6 in entsprechend behandelten primären Hepatozyten, was auf eine Promotor-spezifische Aktivität des Carboxymefloquin-aktivierten PXR hinweist. Amodiaquin und DEAQ reprimierten in primären Hepatozyten die Expression von CYP3A4 und CYP2B6. Dies läßt vermuten, dass diese beiden Substanzen, obwohl sie die Interaktion von PXR mit seinen Ko-Aktivatoren induzieren, nicht die an PXR gebundenen Ko-Repressoren freisetzen können. Diese Ergebnisse sind, angesichts der zentralen Rolle der Artemisinine und Aminochinoline in der zurzeit von der WHO zur Behandlung der Malaria hauptsächlich empfohlenen Artemisinin-Kombinationstherapie (ACT), von besonderem Interesse. Für die zukünftige Weiterentwicklung der ACT könnten die hier gewonnenen Ergebnisse zur Aktivierung von PXR und CAR und eventuell darausfolgende Arzneimittelinteraktionen von Bedeutung sein. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde versucht, genetische Ursachen der ausgeprägten interindividuellen Variabilität der PXR-abhängigen Induktion wichtiger Zytochrom-P450-Enzyme durch Artemsinine zu ermitteln. Die Untersuchung basiert auf einer kürzlich durchgeführten klinischen Studie an 75 Vietnamesen (Asimus et al., 2007), in der die metabolischen Aktivitäten einiger wichtiger PXR/CAR-induzierbarer Zytochrom-P450-Enzyme (z.B. CYP3A4, CYP2C19) nach Behandlung mit Artemisininen bestimmt wurden. Zu diesem Zweck wurden die Promotor-Region, alle Exons und Exon-Intron-Übergänge des PXR-Gens in allen an der klinischen Studie teilnehmenden Individuen vollständig sequenziert. Dieser experimentelle Ansatz ermöglichte die Identifizierung von 32 genetischen Polymorphismen, von denen sechs hier zum ersten Mal beschrieben werden. Die PXR-Polymorphismen 252/275 A> G, 10331 A> G und 10483 T> C waren mit einer stärkeren Induktion der CYP3A4 Aktivität assoziiert. Genau der gegenteilige Effekt wurde jedoch bei der Untersuchung der Induktion der CYP3A4 Expression durch Artemisinin in primären menschlichen Hepatozyten beobachtet. Dies weist daraufhin, dass diese PXR-Polymorphismen die Expression von CYP3A4 wohl nicht direkt beeinflußen. Zusammenfassend, konnten in diesem zweiten Teil der Arbeit einige bereits publizierte Assoziationen von PXR-Polymorphismen mit phänotypischen Veränderungen bestätigt werden. Hinsichtlich einer Assoziation mit dem Ausmaß der Induktion, wurden für die neu identifizierten Polymorphismen jedoch keine eindeutigen Ergebnisse erzielt, was vermutlich auf eine zu kleine Probenzahl zurückzuführen ist. Lediglich der Polymorphismus, der zu der neuen PXR Proteinvariante F420Y führt, ist eindeutig mit einer sehr schwachen Induktion verbunden.