Inhaltszusammenfassung:
Frühere Studien, ausgeführt durch die Biosensor-Forschungsgruppe des Instituts für Klinische und Experimentelle Transfusionsmedizin an der Universität Tübingen, hatten die Blutgruppenbestimmung durch die Wechselwirkung von Erythrozyten mit immobilisierten Antikörpern auf einem Schwingquarzbiosensor (SQ) erfolgreich demonstriert. Diese Studien haben die Möglichkeit eröffnet, neue Anwendungen dieser Technik für die Untersuchung von Infektionskrankheiten zu evaluieren. In unserem Fall waren Studien des erythrozytären Lebenszyklus von P. falciparum, besonders die letzten sechs Stunden, die der Merozoiten-Freisetzung vorangehen, und Studien verbunden mit der Reinfektion durch Merozoiten der Schwerpunkt unserer Forschung.
Die Freisetzung von Malaria-Parasiten von P. falciparum aus infizierten Erythrozyten am Ende ihres asexuellen erythrozytären Lebenzyklus erfolgt alle 48 Stunden und ist asynchron in Parasiten-Kultur und ist synchron in vivo. Dieser Prozess ist wenig untersucht worden. Die Hindernisse sind: (I) Freisetzung der Merozoiten findet in einer kurzen Zeit statt (<60 s) (II) Das Schizonten-Stadium der Parasiten hat eine hohe Empfindlichkeit gegenüber den Labor Bedingungen: pH-Wert und Zusammensetzung des Mediums, osmotischer Druck, Gas-Atmosphäre und Temperatur. (III) Die Erhaltung des Schizonten-Stadiums unter dem Mikroskop ist problematisch, so dass die Freisetzung der Merozoiten schwierig in Echtzeit zu beobachten ist.
Das Ziel des Projektes war, die Freisetzung von Merozoiten von Plasmodium falciparum aus Erythrozyten mit der Schwingquarzbiosensor-Technik zu studieren. Dabei wurde die Änderung der Frequenz, aufgrund der Massenänderung bei der Freisetzung von Merozoiten, und auf einem zweiten Quarz die Reinfektion der nicht infizierten Erythrozyten durch die freigesetzten Merozoiten in Echtzeit beobachtet. Unsere SQ-Experimente beinhalten die folgenden Schritte: (I) Anpassung und Optimierung der Immobilisierung von biologischen Schichten, um Erythrozyten auf dem Quarz zu binden. (II) Optimierung von Bedingungen der Parasiten-Kultur in einer Schwingquarz-Messzelle. (III) Beobachtung des Frequenzsignals für infizierte und nicht-infizierte Erythrozyten und die Korrelation des Signals mit der Freisetzung von Merozoiten. (IV) Reinfektion gesunder Erythrozyten auf einem zweiten Quarz innerhalb eines SQ-System. (V) Test der Hemmung der Freisetzung der Merozoiten und der Reinfektion durch Merozoiten unter Einwirkung von Malariamedikamenten.
Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Anstieg von ~ 1000 Hz am SQ für infizierte Erythrozyten, im Vergleich zu einem SQ mit gesunden Erythrozyten, wo das Frequenzsignal stabil geblieben ist. Mikroskopische Beobachtung der Oberfläche des Quarzes zu unterschiedlichen Zeitpunkten während des Experiments (REM und optisch) zeigte eine Korrelation zwischen dem Anstieg der Frequenz und der Freisetzung von Merozoiten. An diesem Punkt sind etwas mehr als 80% der infizierten Erythrozyten auf dem Quarz an dem Release beteiligt. Reinfektion neuer Erythrozyten wurde auf einem zweiten Quarz beobachtet. pH-Wert des Systems (7.2), Temperatur (37 ° C + / -0,1), Durchfluss des Mediums (9 uL / min), Sterilität des Prozesses (BactAlert), Gas-Atmosphäre (5% O2, Rest N2) wurden eingerichtet, um die Entwicklung der Parasiten und ihr Überleben sicher zu stellen. Externe Kontrollen mitttels Durchflusszytometrie 24 Stunden nach der Reinfektion zeigten einen Prozentsatz von Parasitämie von >1% in den in situ infizierten Erythrozyten.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Schwingquarz-Technologie ein geeignetes und wichtiges neues Instrument ist, um die Biologie des Re-Invasions-Prozesses der Plasmodien aufzuklären.
Abstract:
Previous studies carried out by the Biosensor Research Group of the Institute of Clinical and Experimental Transfusion Medicine at the Tübingen University had successfully demonstrated determination of various blood types through the interaction of erythrocytes with immobilised antibodies on a QCM. These studies have opened the possibility to test new applications of this technique for the study of infectious diseases. In our case, studies of the erythrocyte life cycle of P. falciparum, particularly during the last six hours preceding the merozoite release and studies related to reinfection of erythrocytes by merozoites were the focus of our investigation.
Release of malaria parasites of P. falciparum from infected erythrocyte at the end of their asexual erythrocyte cycle occurs approximately every 48 hours, asynchronously in parasite culture and synchronously in vivo. This process is poorly studied due to: (I) merozoite release is a very short event (<60 s), (II) schizont stages have high sensitivity for culture conditions like pH, medium, osmotic pressure, gas atmosphere and temperature. (III) Schizont conditions are not easy to maintain under the miscrocope, making miscroscopical real time observation of the release difficult.
The aim of the presented project was to study the release of Plasmodium falciparum merozoites from erythrocytes with the QCM sensor technique. In this way, the frequency shift due to the change of mass associated to the merozoite release and, on a second QCM, the reinfection of healthy erythrocytes are monitored in real time. Our QCM experiments included the following stages: (I) Adaptation and optimisation of the immobilisation of biological layers to capture the erythrocytes on the quartz. (II) Optimisation of parasite culture conditions in a QCM chamber. (III) Observation of the frequency signal both for infected and non-infected erythrocytes samples and correlation of the signal with the release of merozoites. (IV) Reinfection of healthy erythrocytes on a second quartz within one QCM system. (V) Test of inhibition of merozoite release and reinfection by antimalarial compounds.
The results showed that there was significant increase of ~1000 Hz for QCM with infected erythrocyte compared to QCM with healthy erythrocytes, where the frequency remained stable. Microscopical observation of the quartz surface at different times during the experiment (TEM and optical) demonstrated a correlation between the increase in frequency and merozoite release. At this point, approximately more than 80% of the infected erythrocytes on the quartz are involved in the release. Reinfection of new erythrocytes was observed on a second QCM. pH of the system (7.2), Temperature (37°C+/-0.1), flow of the medium (9 µL/min), sterility of the process (BactAlert), gas atmosphere (O2 5%, residual N2) were established to ensure parasite development and survival. External controls using flow cytometry 24 hours after the reinfection showed a parasitemia percentage of >1% in the erythrocytes infected in situ.
Our results show, that the QCM technique is an appropriate and important new tool to elucidate the biology of the re-invasion process of Plasmodia.
Quartz Crystal Microbalance , Piezoelectric , Erythrocytic life cycle of Plasmodium falciparum