Die Rolle der Arabidopsis thaliana Proteinphosphatase PP2C5 in der pflanzlichen Antwort auf biotischen und abiotischen Stress

Abstract

Proteinphosphatasen sind wichtige Regulatoren von stressinduzierten MAPK-Kaskaden und können hormonabhängige Signaltransduktionswege beeinflussen. In dieser Arbeit wurde eine PP2C-Phosphatase aus Arabidopsis thaliana charakterisiert, PP2C5, welche zusammen mit ihrem nächsten Homolog AP2C1 sowohl aktivierte MAPKs negativ reguliert als auch in einen positiven Regulationsmechanismus von Abszisinsäure (ABA)-induzierten Signalwegen involviert ist. Für die PP2C5 wurde eine Interaktion mit den im Zellkern co-lokalisierenden stressinduzierten Arabidopsis MAPKs MPK3, MPK4 und MPK6 nachgewiesen. Durch Mutation des Kinaseinteraktionsmotivs (KIM) konnte festgestellt werden, dass die Aminosäuren Lysin an Position 90 und Arginin an Position 91 essentiell für diese Interaktion sind. Da in der pp2c5-Knockoutlinie die MAPKs MPK3, MPK4 und MPK6 deutlich stärker aktiviert sind als in Wildtyppflanzen und in PP2C5- überexprimierenden Tabakblättern die entsprechenden Tabak-MAPKs SIPK (salizylsäureinduzierte Proteinkinase) und WIPK (wundinduzierte Proteinkinase) schwächer aktiviert sind als in Kontrollblättern, konnte die PP2C5 als negativer Regulator dieser MAPKs beschrieben werden. PP2C5 ist durch PAMPs und Pathogene transkriptionell induziert. Allerdings konnte die Annahme, dass die PP2C5 deshalb eine Rolle in der pflanzlichen Immunantwort spielt und PP2C5-Knockoutlinien möglicherweise resistenter gegenüber bakteriellen oder pilzlichen Pathogenen sind, nicht bestätigt werden. Ein möglicher Grund dafür ist die funktionelle Redundanz der PP2C5 mit anderen PP2Cs der B-Gruppe und möglicherweise auch dualspezifischen Proteinphosphatasen. Deshalb wurden Doppelknockoutlinien für verschiedene Kombinationen von Gruppe B-PP2Cs untereinander bzw. mit DsPTPs für weitere Untersuchungen vorbereitet.

Die Induktion der PP2C5-Genexpression erfolgt nicht nur durch PAMPs und Pathogene, sondern auch durch Hormonbehandlungen wie zum Beispiel ABA. Eine nähere Untersuchung der ABA-regulierten Samenkeimung ergab, dass die Keimungsrate der Knockouts ap2c1 und pp2c5 auf mit ABA-versetztem Medium deutlich höher war als die der Wildtypsamen. ABA beeinflusst nicht nur die Keimung von Samen, sondern auch den Öffnungszustand der Stomata. So konnte auch beim Messen der Stomata von unbehandelten Blättern festgestellt werden, dass die Stomataöffnungen der ap2c1 und pp2c5 Knockoutlinien deutlich größer ausfielen als beim Wildtyp und der komplementierten Linie. In beiden Experimenten fiel der Phänotyp im Falle der Doppelknockoutlinie ap2c1 pp2c5 noch deutlich stärker aus als bei den Einzelknockouts, was auf eine funktionelle Redundanz der beiden PP2Cs hindeutet. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass es sich bei der PP2C5 und der AP2C1 um positive Regulatoren von ABA-abhängigen Signalwegen handelt, da sie die keimungshemmende und stomataschließende Wirkung von ABA verstärken. Weiterhin wurde die Genexpression der ABA-responsiven Gene RD29A und Erd10 untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass im Gegensatz zum Wildtyp und den Einzelknockoutlinien RD29A und Erd10 in der Doppelknockoutlinie deutlich schwächer aktiviert wurden. In der Doppelknockoutlinie wurde außerdem eine schwache konstitutive Expression von RD29A und Erd10 festgestellt.

Zusammenfassend ist die PP2C5 somit also eine MAPK-Phosphatase und fungiert als positiver Regulator von ABA-induzierten Signalwegen.

Proteinphosphatases are important regulators of stress induced MAPK cascades and can affect hormone-dependent signal transduction. An Arabidopsis thaliana PP2C-phosphatase, PP2C5, was characterised in this thesis and, together with its closed homolog AP2C1, was shown to negatively regulate activated MAPKs. Additionally both phosphatases were shown to be involved in a positive regulation of ABA-induced signalling. For the nuclear located PP2C5 an interaction with the co-localizing stress-induced MAPKs MPK3, MPK4 and MPK6 was demonstrated. A mutation of the kinase interaction motif (KIM) demonstrated that the amino acids lysine at position 90 and arginine at position 91 are essential for this interaction. As the MAPKs MPK3, MPK4 and MPK6 are stronger activated in pp2c5 knockout plants compared to wild type plants and tobacco MAPKs SIPK and WIPK are weaker activated in PP2C5-overexpressing tobacco leaves compared to control leaves, PP2C5 was characterized as a negative regulator of those MAPKs. PP2C5 is transcriptionally induced after PAMP- and pathogen-treatment. However, the assumption that PP2C5 might play a role in plant innate immunity and that PP2C5-KO-plants might be more resistant to bacteria or fungi could not be confirmed. A potential reason is the functional redundance of PP2C5 with other B-group-PP2Cs or with dual specific protein phosphatases. Therefore different double knockout lines were prepared for further studies.

Induced PP2C5 gene expression occurred not only by PAMPs and pathogens but also after hormone treatment like ABA. Analysis of ABA-regulated seed germination showed a higher germination rate of ap2c1 and pp2c5 mutant plants on ABA-containing medium in comparison to wild type plants. ABA not only affects seed germination but also stomata movements. Measuring stomata apertures of untreated plants revealed larger stomata apertures of ap2c1 and pp2c5 plants in comparison to the wild type. In both experimental setups, the phenotype of ap2c1 pp2c5 double knockout plants was clearly stronger in comparison to the single knockout plants, indicating a functional redundance of these PP2Cs. These observations indicate that PP2C5 and AP2C1 act as positive regulators of ABA-dependent signal transduction because PP2C5 and AP2C1 amplify the germination-inhibiting and the stomata-closing action of ABA. Furthermore, gene expression of ABA-inducible genes was investigated. In contrast to the wild type and the ap2c1 and pp2c5 plants, the ABA-responsive genes RD29A and Erd10 could not be transcriptionally induced by ABA but show a weak constitutive expression in ap2c1 pp2c5 double mutant plants.

In summery, PP2C5 is a MAPK phosphatase that acts as a positive regulator of ABA-induced signal transduction.