Regulation of platelet-type 12-lipoxygenase activity in platelets with special consideration of gender effects

Abstract

The first mammalian lipoxygenase to be discovered in 1974 was platelet-type 12-lipoxygenase (p12-LO) which was named for the site of its discovery. It belongs to a large family of non-heme dioxygenases including 5-lipoxygenase responsible for leukotriene biosynthesis. Although p12-LO was the first lipoxygenase in mammals to be discovered and research has been going on since the discovery, only very little is known about regulation of activity. Involvement in cancer, angiogenesis, hypertension and platelet activation could be attributed to p12-LO activity and its metabolite 12-HETE and suggests the necessity of intensified research. For this study a focus was put on probable regulation in a sex dependent manner, as androgens had recently been found to be involved in regulation of 5-LO and leukotriene biosynthesis. Additionally, in particular for cardiovascular diseases a gender bias with higher incidence in male has been a long established fact, so a possible sex dependent regulation of p12-LO was proposed. To explore p12-LO regulation in general and to elucidate possible sex dependent regulation in particular, a characterisation of p12-LO regulation in platelets was attempted in this work with two different approaches. One, gender differences in regulation of p12-LO and possible influences of sex hormones were investigated. Two, common pharmacological tools, CDC and MK-886, were used to elucidate possible properties of p12-LO in intact cells.

Platelet 12-lipoxygenase is not differently active between the two sexes whether in non-stimulated and stimulated platelets was essentially the same. No differences were manifest in release of AA, subcellular localisation, translocation pattern or protein amount of p12-LO compared in platelets from male and female donors. However, a slight tendency towards lower product formation in female platelets was observed. A strong spontaneous p12-LO activity was measured in non-stimulated platelets and metabolic activity continued over log time periods. p12-LO activity could strongly be enhanced by platelet stimulation with thrombin, collagen, A23187 and arachidonic acid. However, a direct induction of p12-LO activity by these agonists seems improbable. Platelet stimulation rather strongly increases the amount of available substrate for p12-LO as cPLA2 is activated and AA released than activates p12-LO itself.

p12-LO activity was potently and selectively suppressed to a basal level by addition of 1 to 3 µM progesterone in a fast and non-genomic manner. Application of the other sex hormones estradiol and DHT failed to show an effect on p12-LO activity. Only p12-LO was affected by progesterone, other enzymes metabolizing AA as cPLA2 and COX-1 were not affected in any circumstances. [Ca2+]i levels, platelet aggregation, subcellular localisation and translocation pattern of p12-LO were not influenced by progesterone. A direct inhibition of p12-LO by progesterone could furthermore be excluded as no progesterone effect could be observed in homogenate incubations. p12-LO activity is not complete blocked by progesterone but only suppressed to a basal level supporting evidence for p12-LO role as a “house-keeping” enzyme in physiological contexts.

Surprisingly, the hormone progesterone normally acting on genomic levels affects its target enzyme p12-LO in anucleate cells, in platelets. Progesterone impairs p12-LO activity in a rapid, reversible manner as opposed to classical genomic actions. This progesterone effect is possibly mediated by a novel progesterone receptor (mPR) localized in the platelet membranes. Regulation pathways could be identified to involve activation of PKA and ascertain a negative, deactivating regulation of p12-LO activity in stimulated and in non-stimulated cells. PKA most likely converts its influence on p12-LO possibly by phosphorylation of the enzyme as p12-LO contains a phosphorylation motif for PKA.

In vivo progesterone levels reached during pregnancy overlap with effective progesterone concentrations for an inhibition of p12-LO in vitro (0.3 to 1 µM). Attempts to transfer in vitro findings to in vivo conditions showed that progesterone could slightly suppress p12-LO activity in male PRP. Moreover, p12-LO activity in PRP prepared from pregnant females was lower than in controls from male and female. Both findings support an in vivo relevance for the progesterone regulation of p12-LO activity although progesterone probably contributes only marginally to regulation of p12-LO, so more complex mechanisms adding to this effect should be expected.

Die erste in Säugetieren gefundene 12-Lipoxygenase wurde 1974 entdeckt und nach ihrem Entdeckungsort als platelet-type 12-Lipoxygenase (p12-LO) bezeichnet. Die postulierte Rolle der p12-LO und ihres Hauptproduktes 12-HETE in der Krebsentstehung, der Angiogeneseregulation und der Entstehung von Bluthochdruck sowie in der Regulation der Thrombozytenaktivierung macht die Notwendigkeit für intensive Forschung deutlich. Für die vorliegende Arbeit wurde ein besonderer Augenmerk auf die mögliche geschlechtsabhängige Regulation der p12-LO gerichtet, da kürzlich für das verwandte Enzym 5-LO eine Aktivitätsregulation und damit eine Regulation der Leukotrienbiosynthese durch Androgene beschrieben wurde. Da für kardiovaskuläre Erkrankungen, bei welchen ein geschlechtsabhängiges Ungleichgewicht in der Inzidenz bekannt ist, ein Einfluß der p12-LO postuliert wird, wurde auch die p12-LO auf eine geschlechtsabhängige Regulation untersucht.

Um die Regulation der p12-LO und mögliche Einflüsse des Geschlechts auf die p12-LO zu untersuchen, wurden zum einen geschlechtsspezifische Unterschiede der p12-LO Aktivitätsregulierung und mögliche direkte Einflüsse von Geschlechtshormonen auf die p12-LO untersucht. Zum anderen kamen zwei pharmakologische Werkzeuge – CDC und MK-886 – zum Einsatz, um mögliche Regulationsmechanismen und Eigenschaften der p12-LO in intakten Thrombozyten zu beleuchten.

Beim Vergleich von männlichen und weiblichen Zellen weder Unterschiede im Bezug auf p12-LO Aktivität, AA-Freisetzung noch bei subzellulärer Lokalisation, Translokationsmustern oder Proteinmenge der p12-LO festgestellt werden. In unstimulierten Thrombozyten wurde eine ausgeprägte spontane Aktivität der p12-LO gemessen, die kontinuierlich über längere Zeiträume anhielt. Diese basale Aktivität wurde durch Stimulation der Zellen mit Thrombin, Collagen, A23187 Ionophor oder AA deutlich verstärkt. Allerdings scheint eine direkte Aktivierung der p12-LO unwahrscheinlich, vielmehr erhöht die Thrombozytenaktivierung das Angebot an freier AA und damit die Aktivität der p12-LO deutlich, da durch die Stimulation die cPLA2 zur AA-Freisetzung angeregt wird.

Die Aktivität der p12-LO wird durch Zugabe von 1 bis 3 µM Progesteron wirksam und selektiv auf einem basalen niedrigen Niveau gehalten. Der beobachtete Effekt tritt – anders als genregulatorische Effekte – schnell ein und ist reversibel. Behandlung der Zellen mit anderen Geschlechtshormonen wie Estradiol und DHT ergab keinen Effekt. Nur die p12-LO wird von Progesteron in seiner Aktivität beeinflusst, andere Enzyme des AA-Stoffwechsels wie cPLA2 und COX-1 werden in ihrer Aktivität nicht beeinflußt. Intrazelluläre Calciumkonzentration, Thrombozytenaggregation, subzellulare Lokalisation und Translokation der p12-LO wurden von Progesteron nicht verändert. Eine direkte Interaktion der p12-LO mit Progesteron konnte ausgeschlossen werden, da durch Progesteronzusatz zu Thrombozytenhomogenaten keine Inhibition der p12-LO beobachtet wurde.

Überraschenderweise kann das Hormon Progesteron, das seine Funktion auf genomischer Ebene erfüllt, sein Zielenzym auch in kernlosen Zellen, den Thrombozyten, beeinflussen – und zwar in schneller, reversibler Weise, ganz anders als für klassische genomische Effekte zu erwarten wäre. Diese Wirkung des Progesterons wird vermutlich über einen neuartigen Progesteronrezeptor (mPR) vermittelt, der in den Membranen der Thrombozyten lokalisiert sein könnte. Als Endpunkt der angestoßenen Signalwege konnte die PKA als mögliche Effektorkinase identifiziert werden, die eine negative, deaktivierende Regulation der p12-LO in stimulierten und unstimulierten Thrombozyten sicherstellt. Höchstwahrscheinlich übt PKA ihren Effekt auf p12-LO durch Phosphorylierung aus, die Sequenz der p12-LO enthält ein entsprechendes Erkennungsmotiv für die PKA.

Progesteron-Plasmaspiegel in vivo erreichen während der Schwangerschaft Werte, die sich in vitro als effektive Konzentrationen zur p12-LO-Inhibition erwiesen hatten. Um mögliche in vivo Wirkungen des Progesterons abschätzen zu können, wurde Progesteron zu PRP von männlichen Spendern zugesetzt und die Aktivität der p12-LO vermessen. Eine leichte Hemmung der Aktivität wurde beobachtet. In PRP von schwangeren Spenderinnen konnte ebenfalls eine geringere Aktivität der p12-LO festgestellt werden. Beide Ergebnisse zeigen, dass auch in vivo eine Regulation der p12-Lo durch Progesteron in Betracht gezogen werden sollte. Allerdings ist zu erwarten, dass Progesteron nur einen kleinen Beitrag im Regulationsgeschehen leistet und darüber hinaus komplexere Mechanismen an der Regulation der p12-LO beteiligt sind.