Analyse der biologischen Funktion des Parkinson assoziierten Proteins LRRK2 in Knockdown Modellen

Abstract

Das Parkinson-Syndrom (PS) ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung. Aus diesem Grund ist die Erforschung ihrer Pathogenese von zentraler Bedeutung. In dieser Arbeit wurde die biologische Funktion der Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) untersucht. Dieses Protein, welches 2004 identifiziert wurde, ist nicht nur verantwortlich für 5-6% der autosomal dominanten, sondern auch für 1-2% der sporadischen Parkinson-Syndrome.

Diese Arbeit beschreibt erstmals die gesamtgenomischen Auswirkungen des Verlustes von LRRK2 in humanen dopaminergen Zellen und gibt damit einen Einblick in LRRK2-abhängige Signalkaskaden. Dieser Verlust („Knockdown“) konnte auf RNA- und Proteinebene mit Hilfe von RNA-Interferenz erreicht werden. Die Analyse der Gene und Signalkaskaden, welche durch den Verlust von LRRK2 differentiell reguliert werden, führt in dieser Arbeit zu der Betrachtung von drei grundlegenden Fragestellungen.

Apoptoseprozesse werden mit der Pathogenese des PS in Zusammenhang gebracht. Aus diesem Grund befasst sich die erste Fragestellung dieser Arbeit mit dem Einfluss von LRRK2 auf Apoptose-Signalkaskaden. Das gesamtgenomische Expressionsprofil des humanen Zellkulturmodells zeigt einen deutlichen Einfluss des LRRK2-Verlustes auf p53-abhängige Signalkaskaden. Dabei ist p53 ein entscheidender Regulator der Apoptoseprozesse. Auch die Expressionsanalyse von Gehirnen LRRK2-defizienter Tiere bestätigt dieses Ergebnis. Die anschließende funktionelle Analyse im humanen LRRK2-Knockdown-Modell verdeutlicht eine antiapoptotische Wirkung des LRRK2-Verlustes, welcher bei ER-Stress, oxidativem Stress und Kinase-Inhibition auftritt.

Während der Pathogenese des PS kommt es zur Bildung von Lewy-Körperchen, welche als Hauptbestandteil das Protein Alpha-Synuklein beinhalten. Alpha-Synuklein und LRRK2 sind Proteine, welche mit der familiären Form des Parkinson-Syndroms assoziiert sind. Es gibt bisher noch keine Analysen, ob beide Proteine über ihre biologischen Funktionen einen gemeinsamen Pathogenesemechanismus ausüben. Aus diesem Grund wird in der vorliegenden Arbeit das Transkriptom von Alpha-Synuklein-reduzierten, humanen dopaminergen Zellen mit dem Transkriptom von LRRK2-reduzierten Zellen vergleichend analysiert. Deutlich kann herausgestellt werden, dass es Signalkaskaden gibt, welche durch den Verlust beider Proteine dereguliert vorliegen. Die Betrachtung der differentiell regulierten Transkripte verdeutlicht allerdings oft entgegengesetzte Regulationsrichtungen, so dass diese Analysen gegen einen direkten gemeinsamen Pathomechanismus sprechen.

Die dritte Fragestellung dieser Arbeit befasst sich mit dem Einfluss von LRRK2 auf zytoskelettäre Prozesse. Durch die veröffentlichte Interaktion von LRRK2 mit Mikrotubuli und den Einfluss von LRRK2 auf die Neuritogenese, ist eine biologische Funktion von LRRK2 in Zytoskelett-Signalkaskaden zu vermuten. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die mRNA-LRRK2-Expression in Zellkultur unter zytoskelettalem Stress ansteigt. Die Expressionsprofile des humanen wie auch des murinen LRRK2-Knockdown-Modells verdeutlichen, dass besonders Aktin-Zytoskelett-assoziierte Signalkaskaden durch den LRRK2-Verlust dereguliert vorliegen. Besondere Aufmerksamkeit erlangen im humanen Modell nach LRRK2-Verlust die differentiell regulierten Transkripte CDC42 und ARHGEF7. Beide Proteine spielen eine prominente Rolle in Aktin-Zytoskelett-Regulationskaskaden und werden deshalb gemeinsam mit Beta-Aktin auf eine Interaktion mit LRRK2 getestet. Alle drei Proteine zeigen in vitro eine Interaktion sowie in vivo eine Kolokalisation mit LRRK2. LRRK2 besitzt sowohl eine GTPase- als auch eine Kinase-Funktion, welche sich gegenseitig beeinflussen können. Die weitere Charakterisierung der Interaktion zwischen LRRK2 und ARHGEF7 verdeutlicht, dass die Interaktion in diesen zwei Hauptenzymdomänen von LRRK2 stattfindet. Bisher wurde noch kein Guanidin-Austauschfaktor (GEF) von LRRK2 identifiziert, welcher zur Aktivierung der GTPase-Funktion von LRRK2 nötig sein könnte. Die funktionellen in vitro Studien dieser Arbeit zeigen, dass ARHGEF7 das Potential hat, als GEF am LRRK2 wirken zu können, womit dies die Erstbeschreibung eines GEFs am LRRK2 darstellt. In weiteren Bindungsstudien zwischen der GTP-Hydrolyse-defizienten, pathogenen LRRK2 R1441C Mutation und ARHGEF7 kann verdeutlicht werden, dass ein reduziertes Bindungspotential zwischen ihnen vorliegt und dass die GTP-Bindung der R1441C Variante von LRRK2 durch ARHGEF7 ansteigt. Durch die identifizierte Bindung von LRRK2 an CDC42, Beta-Aktin und ARHGEF7 wird in dieser Arbeit eine mögliche Funktion von LRRK2 als Gerüstprotein bei dem Neuritenwachstum herausgestellt und diskutiert.

Diese Arbeit verdeutlicht damit zum ersten Mal, dass gesamtgenomische Expressionsprofile die Basis für Interaktionsstudien sein können, wodurch thesengetrieben funktionelle Analysen möglich werden, welche die biologische Funktion von Proteinen aufzuklären helfen.

Parkinson’s disease is the second most common neurodegenerative disease. Therefore further knowledge of the pathogenesis of this disease is necessary. In this study the biological function of the Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), which was identified in 2004, is analysed. Mutations in LRRK2 contribute to 5-6% of all cases of autosomal-dominant as well as to 1-2% of cases of sporadic Parkinson’s disease. This study elucidates for the first time the whole genome consequences caused by RNA-interference mediated knockdown of LRRK2 on protein and RNA level in human dopaminergic cells. This enables insights in LRRK2 dependent signaling cascades. Analyses of differentially regulated transcripts and signaling cascades, influenced by the loss of LRRK2, highlight 3 cardinal questions, which will be analysed in this study.

Apoptosis has been proposed to contribute to neuronal loss in Parkinson’s disease. Therefore the impact of the knockdown of LRRK2 on apoptosis signaling is examined. Whole genome expression analysis of the LRRK2 knockdown in the human cell culture model reveals a deregulation of p53 depending signaling cascades. The tumor protein p53 is an important regulator of programmed cell death. This result could be confirmed by means of whole genome expression analysis of brains of LRRK2 knockdown mice. Further analysis in the human LRRK2 knockdown model indicates an anti apoptotic effect of the loss of LRRK2 under condition of ER-stress, oxidative stress and kinase inhibition.

Pathological the Parkinson’s disease is characterised by the presence of Lewy bodies in surviving neurons, which contains alpha-synuclein (SNCA). SNCA as well as LRRK2 is a protein associated with autosomal-dominant Parkinson’s disease. Until now there is no investigation, if the biological function of both proteins contributes to the same pathogenesis inducing pathway. These study compares the differentially regulated transcripts of whole genome expression analysis of both SNCA knockdown and LRRK2 knockdown in human dopaminergic cells. The data highlight that there are common signaling cascades, which contain differentially regulated genes in both experiments. Nevertheless the direction of regulation is conflictive. Therefore a common mechanism of SNCA and LRRK2, which probably lead to neurodegeneration in Parkinson’s disease, could not be detected.

The third topic, analysed in this study, is the impact of LRRK2 on cytoskeleton signaling cascades. It is conceivable that LRRK2 have a direct or indirect role in cytoskeleton maintenance because of its published interaction with microtubule and its influence on neuritogenesis. This study shows that the mRNA expression level of LRRK2 is induced under condition of cytoskeleton stress. The microarray analysis in LRRK2 siRNA treated human dopaminergic cells as well as whole genome expression analysis of murine LRRK2 knockdown brains reveal numerous differentially regulated transcripts involved in actin cytoskeleton signal transduction pathways. Detailed analyses point at special impact of the differentially up regulated transcripts CDC42 and ARHGEF7.

Because of their major role in actin cytoskeleton signaling cascades, they are analysed for interaction with LRRK2 additionally to Beta-Actin. All three tested proteins highlight an in vitro interaction and an in vivo colocalisation with LRRK2. The multidomain protein LRRK2 harbours a kinase and GTPase domain and published results show, that the kinase activity is regulated via the intrinsic GTPase activity. The interaction of ARHGEF7 with LRRK2 occurs in these major protein domains. Although suggesting that LRRK2 requires co-factors like guanine nucleotide exchange factors (GEFs) and GTPase activating proteins (GAPs) for its GTPase activity, none of them are known until now. The in vitro data of this study reveal the potential of ARHGEF7 to be the first identified GEF for LRRK2. Further analysis between probably pathogenic LRRK2 variants and ARHGEF7 emphasize a reduced binding between the GTP hydrolysis deficient LRRK2 R1441C variant and ARHGEF7, additionally to an induced GTP binding capacity of the R1441C variant during the presence of ARHGEF7.

By means of the new identified LRRK2 interacting proteins, the impact of LRRK2 as scaffold during neurite outgrowth is discussed.

This work illustrates for the first time, that whole genome expression analyses could be the basis for interaction partner studies and lead to functional scientific hypotheses, which are essential for elucidation of the biological function of proteins.