Development of a New Cell Penetrating Peptide: Design, Synthesis and Applications

Abstract

Cell-penetrating peptides (CPPs) are short membrane permeable peptides of about 30 amino acids. They have gained attention in biomedical field because of their ability to deliver a variety of hydrophobic moieties through the membrane barrier. Being potent vectors, they are also used in the field of intracellular targeting. Though the exact translocation mechanism is still unknown, endocytosis is the most prevalent uptake mechanism seen for highly cationic peptides. However, vesicular encapsulation limits the interaction of the attached cargo with targets present in the cytosol. Thus, a vector is needed which is capable of transferring cargo molecules directly into the cytoplasm. Herein, we reported the development of a novel CPP, CyLoP-1 (Cytosol Localizing Peptide) showing efficient cellular uptake and cytosolic distribution along with vesicular uptake. The application of CyLoP-1 as a delivery agent was further discussed. CyLoP-1 was systematically derived from Crotamine by Structure Activity Relationship (SAR) studies. Crotamine, a polypeptide present in the venom of a South American rattle snake has been shown to be a potential CPP with targeting ability. It is a 42 amino acid polypeptide bearing two putative Nuclear Localization Signal motifs Crot(2-18) and Crot(27-39). Series of peptides were synthesized by Fmoc strategy, introducing mutations in Crot(27-39). SAR studies were done by substitution and/or deletion of amino acid residues in the sequence. All peptides were N-terminally labeled with fluorescein isothiocyanate for optical imaging. After purification by RP-HPLC, the products were lyophilized and characterized by ESI-MS. Uptake of fluorescently labeled peptides was assessed in NIH-3T3 mouse fibroblasts by fluorescence spectroscopy and microscopy. Our studies identified the novel CPP CyLoP-1 (CRWRWKCCKK), which is efficiently delivered into the entire cytoplasm of cells besides being encapsulated in vesicles. Replacing or deleting cysteines had negative impact on internalization. Results also displayed the involvement of tryptophans in cellular uptake indicating, along with cationic amino acids, the importance of each residue in this optimized sequence. CyLoP-1 proved to be most efficient in its natural L-form as SAR studies indicated a clear negative effect of chiral inversion of the amino acid residues on cellular uptake and distribution. Oxidized CyLoP-1 showed enhanced cellular uptake compared to its reduced analogue. The important feature of cytosolic gain was further explored by the covalent attachment of various cargoes to CyLoP-1. Payload consisted of fluorophore, the Magnetic Resonance Imaging agent (Gd)-DOTA, a bio-active peptide (SmacN7), the larger peptide Penetratin, or a Peptide Nucleic Acid molecule. A regular decrease in the uptake and localization pattern concomitant with the increase in the cargo size was observed. Not only the size but also the nature of the cargo seemed to have an influence on the uptake and distribution profile of CyLoP-1 cargo constructs. Efficient intracellular delivery into the entire cytosol and a low cytotoxicity makes CyLoP-1 a promising candidate for cytosolic delivery of cargoes of small sizes. Thus, this peptide might prove to be useful for efficient transmembrane delivery of agents directed to cytosolic targets.

Zellpenetrierende Peptide (CPP) sind kurze, ca. 30 Aminosäure lange Peptide, die in der Lage sind die Zellmembran zu durchdringen. Sie haben Aufmerksamkeit innerhalb der biomedizinischen Forschung erlangt, da sie die Eigenschaft besitzen, eine Vielzahl von hydrophoben Molekülen über die Barriere zu transportieren, die die Zellmembran darstellt. Als wirksame Vektoren werden sie deshalb auch verwendet, um intrazelluläre Zielmoleküle zugänglich zu machen. Obwohl der genaue Mechanismus ihrer Aufnahme immer noch nicht vollständig geklärt ist, ist Endozytose der vorherrschende Weg, der für stark kationische Peptide beobachtet wurde. Die damit verbundene Lokalisierung innerhalb vesikulärer Strukturen innerhalb der Zelle behindert allerdings die Wechselwirkung gekoppelter Wirkstoffe mit Zielmolekülen innerhalb des Zytosols. Deshalb wird ein Vektor benötigt, der Wirkstoffe direkt ins Zytoplasma transportieren kann. Im Rahmen dieser Arbeit wird die Entwicklung eines neuartigen CPP (CyLoP-1, Cytosol Localizing Peptide) beschrieben, das eine effiziente zelluläre Aufnahme sowie eine zytosolische Verteilung neben vesikulärem Transport zeigt. Im Weiteren wird die Anwendung von CyLoP-1 als Vektor für verschiedene Moleküle gezeigt. CyLoP-1 wurde systematisch in einer Struktur-Wirkungs-Studie (SAR) entwickelt. Dabei diente Crotamine als Ausgangsmolekül, ein Peptid aus dem Gift einer südamerikanischen Klapperschlange. Für dieses Peptid war bereits gezeigt worden, dass es selbst ein CPP mit Vektoreigenschaften sein könnte. Dabei handelt es sich um ein Polypeptid mit 42 Aminosären, das zwei potentielle Sequenzen enthält (Crot(2-18) und Crot(27-38), die Moleküle in den Zellkern transportieren sollen. Es wurde eine Reihe von Peptiden mit Hilfe der Fmoc-Technik synthetisiert, wobei Mutationen in Crot(27-39) eingeführt wurden. Dabei wurden gezielt Aminosäuren ausgetauscht und/oder entfernt. Alle Peptide wurden zuletzt am N-Terminus mit Fluoresceinisothiocyanat markiert, um auch die Detektion mit optischen Methoden zu ermöglichen. Nach der Aufreinigung mittels RP-HPLC wurden die erhaltenen Moleküle gefriergetrocknet und mittels ESI-MS charakterisiert. Die Aufnahme der fluoereszenzmarkierten Peptide wurde in NIH-3T3 Mausfibroblasten mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie und –mikroskopie ermittelt. Unsere Untersuchungen identifizierten das neuartige CPP CyLoP-1 (CRWRWKCCKK), als dasjenige, das die beste Aufnahme in Zellen zeigte und, neben vesikulärer Lokalisierung, auch eine effektive Verteilung innerhalb des gesamten Zytosols zeigte. Das Ersetzen der Cysteine oder ihre Entfernung aus der Sequenz hatte einen negativen Effekt auf die Aufnahme. Die Ergebnisse ergaben neben den kationischen Aminosäuren auch eine wesentliche Beteiligung der Tryptophane am Aufnahmeverhalten. Dies zeigte die Bedeutung sämtlicher Aminosäurerest innerhalb der optimierten Sequenz. Daneben konnte gezeigt werden, dass CyLoP-1 am effektivsten in seiner natürlichen L-Form wirken kann, da eine chirale Inversion der Aminosäuren das Aufnahmeverhalten und die Verteilung innerhalb der Zelle klar negativ beeinflussten. Die Oxidation von CyLoP-1 verbesserte dagegen die Aufnahme im Vergleich zum reduzierten Analog. Die herausragende Eigenschaft der Verteilung im gesamten Zytosol wurde im Folgenden durch die kovalente Kopplung verschiedener Wirkmoleküle an CyLoP-1 weiter untersucht. Es wurden Fluorophore, das MRT Kontrastmittel (Gd)-DOTA, ein bioaktives Peptid (SmacN7), das größere Peptid Penetratin, oder eine Peptidnukleinsäuresequenz gekoppelt. Aufnahme und Verteilung innerhalb der Zelle zeigten eine Abhängigkeit von der Molekülgröße. Allerdings bestimmte nicht nur die Größe, sondern auch Natur des Wirkstoffmoleküls das Aufnahme- und Verteilungsmuster der CyLoP-1-gekoppelten Konstrukte. Die effiziente intrazelluläre Aufnahme in das gesamte Zytosol und seine geringe Zytotoxizität machen CyLoP-1 zu einem vielversprechenden Kandidaten für den Transport von kleineren Wirkstoffmolekülen in die Zelle. Deshalb kann sich dieses Peptid auch als nützlich erweisen, um einen effizienten Transport von Wirkstoffen über die Zellmembran zu gewährleisten, die gegen Zielmoleküle im Zytosol gerichtet sind.