Elucidation of molecular mechanisms of apoptosis induction by myrtucommulone from Myrtus communis

Abstract

Extracts of the mediterranean plant myrtle (myrtus communis) have a long tradition in folk medicine as a remedy for the treatment of infections and inflammatory diseases. Over the past decade, many scientific publications could support and rationalise the therapeutic use of myrtle preparations. In search for single components responsible for the beneficial effects, myrtucommulone A (MC), a non-prenylated acylphloroglucinol, was isolated from myrtle leaves and was shown to have strong anti-inflammatory properties. Anti-inflammatory drugs often show beneficial effects on development or progression of cancer. Therefore, it was reasonable to test whether MC might induce apoptosis and to evaluate its potential for treatment of cancer and especially leukaemia.

MC induces apoptosis in cancer cells

In the course of this study it could be shown that MC proved effective in inducing apoptosis in several leukaemia cell lines with marginal cytotoxicity for non-degenerated blood cells. Aside from caspase cleavage, PARP cleavage and DNA fragmentation, loss of the mitochondrial membrane potential and cytochrome c release were the main features in MC-induced apoptosis. Furthermore, it was observed that caspase 9 and the intrinsic way was essential for apoptosis induction by MC, whereas caspase 8 and other components of the extrinsic pathway could be excluded as relevant mediators. The cause for cytochrome c release and activation of caspase 9 was independent of Bcl2 proteins and of the opening of the mitochondrial apoptosis inducing channel or of the opening of the permeability transition pore. Aside from its apoptosis-inducing effect, MC reduced the numbers of viable cells in caspase 9-deficient Jurkat cells, although apoptosis was clearly abrogated. This effect was not related to necrosis but rather due to G2 phase arrest induced by MC. We conclude that MC may affect cell metabolism and signaling pathways, slowing growth of cancer cells compared to non-degenerated cells due to differences in activation of metabolic pathways and gene expression.

MC inhibits signaling pathways

To elucidate the effects of MC on signal transduction pathways in PMNL and to check if similar effects are obvious in cancer cells, the phosphorylation states of several kinases in PMNL and HL60 cells were assessed. MC concentration dependently inhibited phosphorylation of ERK, p38 MAPK and Akt/PKB in leukaemic HL60 promyelocytes and in non-degenerated human PMNL. Whereas MC reduced activation of Ras, Raf and MEK upstream of ERK in PMNL, this pathway was unaffected by MC in HL60 cells. The effects of MC were also independent of PKC, since phosphorylation of the direct PKC substrate MARCKS was not affected. Although in PMNL MC blocked kinase activation following simulation with fMLP, PMA and other stimuli, in HL60 cells no stimulation was needed to see a strong inhibitory effect by MC on ERK phosphorylation. This influence of MC on especially ERK and p38 MAPK implies consequences on NFkappaB transcriptional activity in K562 chronic myeloid leukaemia cells and on fMLP-induced chemotaxis in PMNL. In conclusion, MC exhibits potent and manifold effects on signaling pathways involved in inflammation and apoptosis induction. Thus, MC has the potential as an effective and selective therapeutic to treat inflammation.

Extrakte der Myrthe (myrtus communis) werden seit jeher in der Volksmedizin als Mittel gegen Infektionen und entzündliche Erkrankungen angewendet. Während der letzten Jahrzehnte konnte diese Wirkung von Myrthe-Extrakten durch mehrere wissenschaftliche Arbeiten belegt und somit deren therapeutische Anwendung gerechtfertigt werden. Das nichtprenylierte Acylphloroglucinol Myrtucommulon A (MC) wurde zum ersten mal 1974 aus den Blättern der Pflanze isoliert. Man konnte zeigen, daß es stark antiinflammatorische Eigenschaften hat. Da entzündungshemmende Stoffe oftmals hemmend auf Ausbildung und Fortschreiten von Kebserkrankungen wirken, wurde MC auf Apoptose-induzierende Eigenschaften untersucht und getestet, ob es als Therapeutikum gegen Krebs und vor allem Leukämie geeignet ist.

MC induziert Apoptose in Krebszellen

Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß MC in verschiedenen Leukämie-Zelllinien Apoptose induziert. Dabei ist es für nicht-degenerierte Leukozyten nur in weitaus höheren Konzentrationen zytotoxisch. Neben der Spaltung von Caspasen, PARP und der Fragmentierung der DNA, konnten der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials und Cytochrom c-Freisetzung aus den Mitochondrien als Hauptbestandteile der MC-induzierten Apoptose identifiziert werden. Weiterhin wurde beobachtet, daß Caspase 9 und der intrinsiche Weg der Apoptoseinduktion essentiell für die beobachteten Effekte sind. Caspase 8 und weitere Komponenten des extrinsischen Wegs konnten dagegen für die apoptotische Wirkung des MC ausgeschlossen werden. Die Cytochrom c-Freisetzung und Aktivierung von Caspase 9 erfolgten unabhängig von Bcl2 Proteinen und der Öffnung des “mitochondrial apoptosis inducing channel” (MAC) sowie unabhängig von der Öffnung der “permeability transition pore“ (PTP). Weiterhin induzierte MC einen G2-Phase-Arrest in Caspase 9 defizienten Jurkat Zellen, der den Rückgang der Zahl lebender Zellen erklärt, obwohl in diesen Zellen keine Apoptose induziert bzw. Nekrose ausgelöst werden konnte. MC hat möglicherweise einen Effekt auf den Zellmetabolismus und Signalwege, der das Wachstum von Krebszellen im Gegensatz zu dem von nicht-degenerierten Zellen verlangsamt, da es zu Unterschieden in Stoffwechselaktivierung und Genexpression kommt.

MC inhibiert die Signaltransduktion

Um die Effekte von MC auf die Signaltransduktion in PMNL aufzuklären und um zu testen, ob ähnliche Effekte in Krebszellen zu beobachten sind, wurde der Phosphorylierungsstatus verschiedener Kinasen in PMNL und HL60 überprüft. MC inhibierte konzentrationsabhängig sowohl in leukämischen HL60 Zellen als auch in nicht-degenerierten menschlichen PMNL die Phosphorylierung von ERK, p38 MAPK und Akt/PKB. Obwohl MC in PMNL die Aktivierung von Ras, Raf und MEK oberhalb von ERK unterbinden konnte, so hatte es keinen Einfluß auf diesen Weg in HL60 Zellen. Die Effekte von MC waren unabhängig von der PKC, da die Phosphorylierung des direkten PKC-Substrats MARCKS von MC unbeeinflußt blieb. In PMNL inhibierte MC die Aktivierung dieser Kinasen nach Stimulation mit fMLP, PMA oder anderen Stimuli. In HL60 wurde dagegen kein Stimulus benötigt, um einen starken inhibitorischen Effekt des MC auf die ERK-Phosphorylierung zu sehen. Dieser Einfluß von MC auf die Aktivierung von ERK und p38 könnte eine Erklärung dafür sein, warum MC in K562 Zellen (CML) die transkriptionelle Aktivität von NFkappaB hemmt und einen ebenfalls hemmenden Einfluß auf die Chemotaxis in PMNL besitzt. Zusammenfassend zeigt MC potente und vielfältige Effekte auf Signaltransduktionswege, welche vor allem bei Entzündungsprozessen und Apoptose-Induktion (bzw. -unterdrückung) eine Rolle spielen. Demnach hat MC das Potential, als effektives und vor allem selektives Therapeutikum gegen entzündliche Erkrankungen und Krebs ein