Receptors in the Regulation of Suicidal Erythrocyte death

Abstract

Eryptosis is characterized by cell shrinkage, cell membrane scrambling with subsequent exposure of phosphatidylserine at the erythrocyte surface. Activation of the erythrocytes Ca2+ permeable cation channel triggers suicidal erythrocyte death. Therefore eryptosis may contribute to physiological limitation of erythrocyte survival and there is strong evidence between excessive stimuli of eryptosis and the presence of clinical signs of anemia.

Sepsis is paralleled by anemia, an effect resulting from eryptosis, the suicidal death of erythrocytes. Pathogen-induced eryptosis may partially result from interaction of bacterial cell wall components such as lipoproteins with the erythrocyte cell membrane. The first study explored, whether the synthetic lipopeptide Pam3CSK4 mimicking the acylated amino terminus of bacterial lipoproteins triggers eryptosis. According to annexin-V-binding in FACS analysis, Pam3CSK4 (1 myg/ml) stimulated phosphatidylserine exposure, an effect significantly blunted in the nominal absence of Ca2+. According to Fluo3 fluorescence, Pam3CSK4 increased cytosolic Ca2+ activity and moderately stimulated erythrocytic ceramide formation, both are considered to be major triggers of eryptosis. In conclusion, bacterial lipoproteins participate in the stimulation of erythrocyte cell membrane scrambling by bacterial cell wall components. Thus, lipoprotein-dependent suicidal erythrocyte death may contribute to the pleiotropic effects of sepsis.

The second study explored, whether GluA1 is expressed in human erythrocytes and whether the pharmacological inhibition of the AMPA receptor modifies Ca2+ entry and suicidal death of human erythrocytes. GluA1 protein abundance was determined by confocal microscopy; PS exposure was estimated from annexin V-binding, cell volume from forward scatter, cytosolic Ca2+ concentration from Fluo3 fluorescence by FACS analysis, and channel activity by whole cell patch clamp recordings. GluA1 was indeed found to be expressed in the erythrocyte cell membrane. The AMPA receptor antagonist NBQX (1, 2, 3, 4-tetrahydro-6-nitro-2,3-dioxo-benzo[f]quinoxaline-7-sulfonamide) inhibited the suicidal cation channels activated by iso-osmotic cell shrinkage following Cl- removal and the eryptosis following Cl- removal or energy depletion. The present study reveals a novel action of AMPA receptor antagonists and raises the possibility that GluA1 or a pharmacologically related protein participates in the regulation of Ca2+ entry into and suicidal death of human erythrocytes. .

The third study explored the involvement of leukotrienes in the regulation of eryptosis. Western blotting was employed to detect the cysteinyl-leukotriene receptor cysLT1 and a competitive immune assay to determine leukotriene release from erythrocytes, Fluo3 fluorescence to estimate cytosolic Ca2+ concentration, forward scatter to analyse cell volume and annexin V-binding to disclose phosphatidylserine exposure by Facs analysis. As a result, erythrocytes expressed the leukotriene receptor CysLT1. Glucose depletion (24 hours) significantly increased the formation of the cysteinyl-leukotrienes C4/D4/E4. Leukotriene C4 (10 nM) increased Ca2+ entry, decreased forward scatter, activated caspases 3 and 8, and stimulated annexin V-binding. Glucose depletion similarly increased annexin V-binding, an effect significantly blunted in the presence of the leukotriene receptor antagonist cinalukast (1 myM) or the 5-lipoxygenase inhibitor BW B70C (1 myM). In conclusion, upon energy depletion erythrocytes form leukotrienes, which in turn activate cation channels, leading to Ca2+ entry, cell shrinkage and cell membrane scrambling. Cysteinyl-leukotrienes thus participate in the signaling of eryptosis during energy depletion.

Taken together, the study displays the functional significance of some receptors like GluA1 and CysLT1 which directly or indirectly regulate the suicidal erythrocyte death and survival.

Sepsis geht mit Mikrozirkulationsstörungen einher, was zumindest teilweise auf die Stimulation von Eryptose zurückzuführen sein dürfte. Durch Erreger hervorgerufene Eryptose dürfte sich teilweise aus der Wechselwirkung zwischen bakteriellen Zellwandbestandteilen, wie Lipoproteinen, mit der Zellmembran der Erythrozyten ergeben. Die erste Studie untersuchte, ob das künstliche Lipoprotein Pam3CSK4, das den azylierten N-Terminus von bakteriellen Lipoproteinen nachahmt, Eryptose auslöst. Die durchflusszytometrische Untersuchung der Annexin-V-Bindung, ergab, dass Pam3CSK4 (1 µg/ml) die Phosphatidylserinexposition humaner Erythrozyten auslöste. Dieser Effekt wurde signifikant durch die Abwesenheit von Ca2+ abgeschwächt. Messungen der Ca2+ abhängigen Fluo3-Fluoreszenz ergaben, dass Pam3CSK4 die zytosolische Ca2+-Aktivität erhöht und die Zeramidbildung in Erythrozyten mäßig stimuliert. Beide Veränderungen sind typische Auslöser der Eryptose. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass bakterielle Lipoproteine an der Stimulation der Skramblase mit nachfolgender Phosphatidylserinexposition in Erythrozyten durch bakterielle Zellwandkomponenten beteiligt sind. Demzufolge könnte der lipoproteinabhängige suizidale Erythrozytentod zu den pleiotropen Effekten der Sepsis beisteuern. Die zweite Studie erforschte, ob GluA1 in menschlichen Erythrozyten exprimiert wird und ob die pharmakologische Hemmung von AMPA-Rezeptoren die Ca2+-Aufnahme und den suizidalen Erythrozytentod verändert. Die Expression des GluA1ä-Proteins wurde durch konfokale Mikroskopie, Phosphatidylserinexposition, durch Annexin-V-Bindung, das Zellvolumen durch das Signal des Vorwärtsstreulichts, die zytosolische Ca2+-Konzentration durch Fluo3 Fluoreszenz jeweils duchflusszytometrisch und die Kanalaktivität durch elektrophysiologische Messungen mit der Membranfleckklemme bestimmt. Demzufolge wird GluA1 tatsächlich in der Zellmembran von Erythrozyten exprimiert. Der AMPA-Rezeptoranatagonist NBQX (1, 2, 3, 4-Tetrahydro-6-nitro-2,3-dioxobenzo[f]quinoxalin-7-sulfonamid) hemmte die suizidalen Kationenkanäle, die durch isoosmotische Zellschrumpfung in Folge von Cl--Wegnahme aktiviert wurden, und die Eryptose als Folge von Cl--Wegnahme oder Energiedepletion. Die vorliegende Studie deckt einen neuen Effekt der AMPA-Rezeptoranatgonisten auf und lässt es wahrscheinlich erscheinen, dass GluA1 oder ein pharmakologisch verwandtes Protein an der Regulation des Ca2+-Eintritts in und am suizidalen Tod von menschlichen Erythrozyten beteiligt ist.

Die dritte Studie erforschte die Beteiligung von Leukotrienen an der Regulation der Eryptose. Mittels Western Blots konnte der Cysteinyl-Leukotrien-Rezeptor cysLT1 nachgewiesen werden. Durch kompetitiven Immunoassay wurde die Leukotrienfreisetzung aus Erythrozyten bestimmt. Duchflusszytometrisch wurde durch Fluo3-Fluoreszenz die zytosolische Ca2+-Konzentration abgeschätzt, mit dem Signal des Vorwärtsstreulichtes das Zellvolumen analysiert und mit der Annexin-V-Bindung die Phosphatidylserinexposition ermittelt. Glukosedepletion (24 Stunden) erhöhte signifikant die Bildung von Cysteinyl-Leukotrienen C4/D4/E4. Leukotrien C4 (10 nM) erhöhte den Ca2+-Einstrom, erniedrigte das Signal des Vorwärtsstreulichtes, aktivierte die Caspasen 3 und 8 und stimulierte die Annexin-V-Bindung. Die Glukosedepletion erhöhte gleichermaßen die Annexin-V-Bindung, ein Effekt, der signifikant durch die Anwesenheit des Leukotrienrezeptorantagonisten Cinalukast (1 µM) oder den 5-Lipoxygenase-Inhibitor BW B70C (1 µM) abgeschwächt wurde. Zusammenfassend ergibt sich, dass Erythrozyten bei Energiedepletion Leukotriene bilden, welche dann sinngemäß Kationenkanäle aktivieren, was dann zu Ca2+-Einstrom, Zellschrumpfung und Externalisierung von Phosphatidylserin führen. Cysteinyl-Leukotrien ist daher am Signalweg der Eryptose während der Energiedepletion beteiligt.

Zusammengefaßt zeigen die Studien die Bedeutung membranöser Rezeptoren für die Regulation des suizidalen Erythrozytentodes.