Biosynthesis of aminocoumarin antibiotics in Streptomyces: Investigations on the regulation of novobiocin production

Abstract

The aminocoumarin antibiotics novobiocin, clorobiocin and coumermycin A1 are produced in different Streptomyces strains and are potent inhibitors of DNA gyrase. Cloning and sequencing of the corresponding biosynthetic gene clusters allowed detailed investigations of their biosynthetic pathways as well as the generation of novel antibiotics by metabolic engineering, chemo-enzymatic synthesis and precursor-directed biosynthesis. On the other hand, only limited knowledge is available about the regulation of the biosynthesis of the aminocoumarin antibiotics. The biosynthetic gene cluster of novobiocin, clorobiocin and coumermycin A1 each contains two putative regulatory genes with high similarity in between the clusters, i.e. novG/cloG/couG and novE/cloE/couE. The function of NovG as a DNA binding protein and positive regulator of novobiocin biosynthesis has been established previously. In the first part of this thesis, functional proof for the role of novE as a positive regulator of novobiocin biosynthesis is provided. Overexpression of novE, using a replicative shuttle vector in S. coelicolor strains carrying the intact novobiocin cluster has been shown to lead to almost two-fold overproduction of novobiocin, suggesting that novobiocin production is limited by the availability of NovE protein. In contrast, a novE-defective mutant, generated by an in-frame deletion in this study, produced only 0.7 % of the novobiocin amount formed by an S. coelicolor strain harboring the intact novobiocin cluster. Novobiocin production in this Delta novE mutant could be restored by introduction of an intact copy of novE, but also by overexpression of the regulatory gene novG. NovE was expressed in E. coli and purified. However, in contrast to NovG, no DNA binding properties could be shown for NovE. The following RT-PCR experiments showed that at least some novG transcription can occur in the absence of NovE, and that novE transcription can occur in the absence of NovG. Correspondingly, overexpression of novG under control of its own promoter stimulated novobiocin production even in a novE-defective mutant. Another part of this thesis focuses on the determination of promoter regions within the novobiocin biosynthetic gene cluster. For this purpose Omega interposons, i.e. DNA fragments containing an antibiotic resistance marker flanked by short inverted repeats containing termination signals for transcription, were introduced into genes downstream of putative promoter regions, i.e. into novE, novF, novG, novH, novO, novP, novQ and novS, resulting in termination of mRNA synthesis at the place of insertion. Transcription is re-initiated at the next active promoter-sequence downstream of the Omega insertion. RT-PCR analysis of the generated mutants showed that the novobiocin biosynthetic gene cluster contains, in addition to previously identified promoter regions upstream of novE and gyrBR, six further promoter regions situated upstream of novF, novG, novH, novO, novP and novQ. In order to confirm the importance of the promoter regions identified upstream of novO, novP and novQ, quantitative RT-PCR experiments were carried out to quantify transcription of novH, novP and novQ in the Omega novH mutant in comparison to S.coelicolor strains containing the intact novobiocin cluster. The results of these investigations clearly showed that the Omega insertion into novH resulted not only in an almost complete loss of novH transcription (< 1 %), but additionally in a very strong reduction of transcription of novP and novQ (<3 %). This finding strongly suggests that transcription of novO, novP and novQ (and of the genes located downstream thereof) is mainly controlled by the novH promoter initiating a large transcript of at least 18 kb, i.e. from novH to novW. Furthermore, quantitative RT-PCR was used for investigations of the interplay of the two positive regulators novE and novG, as well as on their influence on the novobiocin biosynthetic genes. These investigations showed that both novE and novG act as transcriptional activators of the genes of novobiocin biosynthesis by initiating transcription from the novH-promoter. novE and novG act in a cascade-like reaction mechanism, i.e. novE positively regulates transcription of novG and NovG regulates transcription of all genes from the novH promoter by binding to a well-defined inverted repeat sequence in the intergenic region between novG and novH. Based on the results presented above, the final part of this thesis deals with the uncoupling of novobiocin production from its natural regulation cascade by replacing the entire novEFG-region, including the promoter region upstream of novH, by a strong inducible promoter. For this purpose, the tetracycline-controllable promoter 830 (tcp830) was used. It has been shown previously, by using luxAB genes expressing luciferase as a reporter system, that induction factors of up to 270 could be obtained for tcp830 by induction with anhydrotetracycline. HPLC analysis of novobiocin production in the resulting mutants showed that an induced tcp830 promoter is sufficient to cause transcription of the genes from novH to novW, i.e. of a polycistronic mRNA of >18.000 nt, resulting in a two-fold overproduction of novobiocin in comparison to strains containing the unmodified novobiocin gene cluster. Therefore, regulation of novobiocin production by tcp830 has been confirmed as a strategy to uncouple novobiocin production from its natural regulation and notably as a further, newly discovered tool to enhance antibiotic production.

Die Aminocoumarin-Antibiotika Novobiocin, Clorobiocin und Coumermycin A1 werden von unterschiedlichen Streptomyces-Stämmen gebildet und sind potente Gyrasehemmstoffe. Klonierung und Sequenzierung der Biosynthesegencluster dieser Antibiotika ermöglichten detaillierte Untersuchungen der Biosynthesewege und die Herstellung neuer Antibiotika durch metabolisches Engineering, chemo-enzymatische Synthese und Vorstufen-gerichtete Biosynthese. Das Wissen über die Regulation der Aminocoumarin-Biosynthese ist jedoch begrenzt. Die Biosynthese-Gencluster von Novobiocin, Clorobiocin und Coumermycin A1 enthalten jeweils zwei putative Regulatorgene, novG/cloG/couG und novE/cloE/couE, mit starker Ähnlichkeit zwischen diesen Clustern. Die Funktion von NovG als DNA-bindendes Protein und positiver Regulator in der Novobiocinproduktion wurde bereits vor Beginn dieser Arbeit nachgewiesen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Funktionsnachweis für novE als positiver Regulator der Novobiocinproduktion erbracht. Die Überexpression von novE mit Hilfe eines replikativen Shuttle-Vektors in Streptomyces coelicolor-Stämmen mit intaktem Novobiocin-Biosynthesegencluster führte zu einer nahezu zweifachen Überproduktion von Novobiocin, was darauf hindeutet, dass die Novobiocinproduktion durch die Verfügbarkeit von NovE-Protein begrenzt wird. Im Gegensatz dazu produzierte die in dieser Arbeit durch „in-frame“ Deletion hergestellte novE-Defektmutante lediglich 0.7% der Novobiocinmenge, die von Streptomyces coelicolor Stämmen mit intaktem Novobiocincluster produziert wird. Die Novobiocinproduktion in dieser novE-Defektmutante konnte nicht nur durch das Einbringen einer intakten Kopie von novE, sondern auch durch Überexpression von novG wiederhergestellt werden. NovE wurde in Escherichia coli exprimiert und aufgereinigt. Im Gegensatz zu Experimenten mit NovG konnte für NovE jedoch keine DNA-bindende Eigenschaft nachgewiesen werden. Die folgenden RT-PCR Untersuchungen zeigten, dass zumindestens etwas novG-Transkription in Abwesenheit von NovE, und novE-Transkription in Abwesenheit von NovG stattfindet. In Übereinstimmung damit stimulierte die Überexpression von novG unter Kontrolle des eigenen Promotors die Novobiocinproduktion auch in der novE-Defektmutante. Der folgende Teil dieser Arbeit zielte auf die Identifizierung der Promotorregionen innerhalb des Novobiocin-Biosynthesegenclusters. Zu diesem Zweck wurden Omega Interposons, das heißt DNA-Fragmente, die einen Antibiotika-Resistenzmarker beidseitig flankiert durch Sequenzen, die Terminationssignale für die Transkription beinhalten, in Gene downstream von putativen Promotorregionen eingebracht, das heißt in novE, novF, novG, novH, novO, novP, novQ und novS. Dies führte zu einer Termination der mRNA-Synthese. Die Wiederaufnahme der Transkription erfolgt von der nächsten aktiven Promotor-Sequenz downstream der Omega-Insertion. RT-PCR Untersuchungen der generierten Mutanten zeigten, dass im Novobiocin-Biosynthesegencluster, zusätzlich zu den bereits identifizierten Promotorregionen upstream von novE und gyrBR, sechs weitere Promotorregionen enthalten sind, die sich upstream von novF, novG, novH, novO, novP und novQ befinden. Zur Bestätigung der Rolle der Promotorregionen upstream von novO, novP und novQ, wurden quantitative RT-PCR (qRT-PCR) Experimente durchgeführt um die Transkription von novH, novP und novQ in der Omega novH-Mutanten im Vergleich zu Streptomyces coelicolor-Stämmen mit intaktem Novobiocincluster zu quantifizieren. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten eindeutig, dass die Omega-Insertion in novH nicht nur zu einem nahezu vollständigen Ausfall der novH-Transkription (< 1%), sondern auch zu einer sehr starken Reduktion der Transkription von novP und novQ (<3 %) führt. Diese Ergebnisse machen wahrscheinlich, dass die Transkription von novO, novP und novQ sowie der downstream davon liegenden Gene hauptsächlich über den novH-Promotor kontrolliert wird, von dem ein mindestens 18 kb großes Transkript, das heißt von novH bis novW, gebildet wird. Außerdem wurde mittels qRT-PCR das Zusammenspiel der beiden positiven Regulatoren novE und novG, sowie deren Einfluss auf die Novobiocin-Biosynthesegene untersucht. In diesen Untersuchungen wurden novE und novG als Transkriptionsaktivatoren der Novobiocinproduktion bestätigt, welche in einer Regulationskaskade die Transkription vom novH-Promotor aus initiieren. Offenbar aktiviert novE die Transkription von novG und NovG reguliert über den novH-Promotor die Transkription aller Gene durch Bindung an eine definierte Sequenz im intergenischen Bereich zwischen novG und novH. Basierend auf den oben präsentierten Ergebnissen beschäftigte sich der letzte Teil dieser Arbeit mit der Entkopplung der Novobiocinproduktion von deren natürlichem Regelkreis durch Austausch der gesamten novEFG-Region, einschließlich der Promotorregion upstream von novH, gegen einen starken Promotor. Hierzu wurde der Tetracyclin-induzierbare Promotor 830 (tcp830) verwendet, für den mit den Luciferase-kodierenden Genen luxAB als Reporter-System Induktionsfaktoren von bis zu 270 beschrieben wurden. Die HPLC-Analyse der Novobiocinproduktion in den generierten Mutanten zeigte, dass der tcp830-Promotor erfolgreich eingesetzt werden kann, um eine 18 kb umfassende Region von novH bis novW zu transkribieren, was zu einer zweifachen Überproduktion von Novobiocin führte. Die Regulation der Novobiocinproduktion über tcp830 wurde dadurch nicht nur als eine Strategie zur Entkopplung der Novobiocinproduktion von deren natürlichem Regulationskreis, sondern auch als ein weiteres, neue entdecktes Werkzeug zur Erhöhung der Antibiotikaproduktion bestätigt.