Untersuchung des Terminations/Reinitiations-Mechanismus der Translation des kleinen Kapsidproteins beim Felinen Calicivirus

Abstract

Die Caliciviren umfassen eine Gruppe tier- und humanpathogener Viren mit einem Genom positiver Polarität. Die caliciviralen Strukturproteine werden ausgehend von einer subgenomischen RNA translatiert, die zwei überlappende Leseraster enthält. Das erste Leseraster kodiert für das virale Hauptkapsidprotein VP1 und das zweite für das minore Kapsidprotein VP2. In transienten Expressionsstudien war die VP2-Translationseffizienz ca. 20fach geringer als die des VP1. Für das Feline Calicivirus (FCV) konnte im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit gezeigt werden, dass die Translation des VP2 mittels eines speziellen Terminations/Reinitiations-Mechanismus erfolgt. So konnte über verschiedene Mutanten nachgewiesen werden, dass die Translation des VP2 von der Translation des VP1 abhängt, das Ribosom bis zur Startstelle des VP2 gelangen muss, und des Weiteren die Termination der VP1-Translation in relativer Nähe zum VP2 Start erfolgen muss, damit sich eine Reinitiation ereignen kann. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass ein AUG als Startkodon nicht essentiell ist. Es erfolgt jedoch eine „de novo“ Translationsinitiation unter Verwendung der spezifischen Initiator-tRNAMet. Mittels Deletionsanalysen konnte gezeigt werden, dass dieser spezielle Terminations/Reinitiations-Mechanismus auf einer Sequenz von ca. 70 Nukleotiden stromauf der Start/Stoppregion basiert, die als TURBS (‘‘termination upstream ribosomal binding site’’ ) bezeichnet wurde. Innerhalb dieser TURBS-Region konnten drei essentielle Motive bestimmt werden. Bei Motiv 1 handelt es sich um eine konservierte Region innerhalb der caliciviralen RNAs, zu der sich eine komplementäre Region innerhalb der Säuger 18S rRNA findet. Durch reziproke Austausche innerhalb des Motivs 1 sowie der komplementären 18S rRNA Region, konnte die Bedeutung der Hybridisierung dieser beiden RNAs für die Translation des VP2 in einem Hefesystem nachgewiesen werden. Diese intermolekulare Interaktion führt vermutlich zum Festhalten des postterminalen Ribosoms an der FCV-RNA. Motiv 2 ist ca. 20 Nukleotide stromauf von der VP2 Startstelle gelegen, während Motiv 2* direkt vor Motiv 1 lokalisiert ist. Motiv 2 und 2* sind komplementär zueinander und bilden vermutlich intramolekulare Paarungen aus, die zu einer Sekundärstruktur führen, die das Motiv 1 präsentiert und einen bestimmten Abstand zum VP2-Start festlegt und somit das Ribosom am Startpunkt positioniert. Die in der vorliegenden Doktorarbeit vorgestellten Daten, führen zu einem besseren Verständnis der Grundlagen dieses speziellen Terminations/Reinitiations-Mechanismus der Translationsinitiation bei Eukaryoten. Zum ersten Mal gelang es die mechanistische Basis für eine Translationsreinitiation höherer Zellen aufzuklären.

The familiy Caliciviridae contains positive strand RNA viruses that represent important human and animal pathogens. The caliciviral structure proteins are expressed from a subgenomic mRNA with two overlapping open reading frames (ORFs). The first ORF of this RNA codes for the viral major capsid protein VP1, and the second ORF for the minor capsid protein VP2. In transient expression studies, the efficiency of VP2 translation was about 20 times lower than that of VP1. The studies on the feline calicivirus (FCV) showed that translation of VP2 is achieved by a special termination/reinitiation-mechanism. VP2 translation depends on translation of VP1, the ribosome has to get to the startpoint of VP2 to allow reinitiation, and the termination of VP1 translation has to occur in close vicinity to the VP2 start site. Furthermore, it was shown that an AUG is not essential as the start codon. A „de novo“ translation initiation with the specific initiator-tRNAMet takes place. Deletion mapping revealed that this special termination/reinitiation-mechanism leading to expression of VP2 depends on a sequence of about 70 nucleotides upstream of the start/stop region, denoted as TURBS (‘‘termination upstream ribosomal binding site’’ ). The TURBS region contains 3 short sequence motifs essential for VP2 translation as determined by deletion mapping and substitution analyses. Motif 1 is conserved among caliciviruses and is complementary to part of the mammalian 18S rRNA. The importance of hybridization of these two RNAs for VP2 translation was shown in a yeast system via reciprocal exchanges within motif 1 and as well in the complementary 18S rRNA region. This intermolecular interaction leads probably to tethering of posttermination ribosoms on the FCV RNA. Motif 2 is located ca. 20 nucleotides upstream of the VP2 startsite whereas motif 2* directly preceds motif 1. Motif 2 und 2* show sequence complementarity and are supposed to establish a intramolecular pairing leading to a secondary structure, that presents motif 1 and defines a certain distance to the VP2 startcodon and thus positions the ribosome relative to the start site. The analyses led to a better understanding of the requirements for translation termination/reinitiation in eukaryotes. For the first time a mechanistic basis for translation/reinitiation of higher cells was found.