Development of Magnetic Resonance Guided Functional and Anatomical Markers for the Brain

Abstract

The long term goal of the projects carried out during this doctoral thesis was to map functional activity in the living brain. Currently available methods are hemodynamic-based (e.g. functional magnetic resonance imaging, fMRI) and are thus considered to report neural activity only indirectly. A more direct and precise way of mapping functional activity in the brain is to target indicators which are believed to be tightly coupled to neural activity such as membrane potential, pH, Ca2+, Na+, Cl-, neurotransmitter flux etc. Amongst the various ion fluxes, the neural activity dependent modulation in Ca2+ concentration has been studied extensively in optical imaging. A wide variety of Ca2+ sensitive fluorescent indicators, originally developed by Roger Tsien, are available to investigate the role of Ca2+ in various signaling events during normal and pathological conditions. These techniques, however, suffer from photobleaching side products, inability to record from deeper brain structures and the limitation with whole brain coverage. In order to get a non-hemodynamic method of mapping brain activation with no depth penetration limit and possibility to record from the whole brain, we aimed at the development of MR detectable functional probes having the ability to sense the Ca2+ modulation and translate it in the form of dynamic MR contrast. Such probes are called smart contrast agents (SCA). Unlike designing agents for microinjections in cells we proceeded with designing agents able to sense extracellular Ca2+ in a concentration range of 1-2 mM. This required a CA with a low affinity Ca2+ chelator. We, therefore, modified a well known strong chelator of Ca2+, BAPTA, and coupled it to two Gd-DO3A moieties resulting in a low Ca2+ binding construct. A variety of bismacrocyclic CA were synthesized and characterized. However, the maximum relaxivity (relaxation rate per mM of CA) enhancement that could be obtained with these agents was 15% with 10 equiv. of Ca2+. To improve the sensitivity, monomacrocyclic agents based on the low affinity chelator APTRA were synthesized and characterized. All the agents synthesized in this series (Ln-L5-9) except Ln-L6 showed an excellent sensitivity to Ca2+. The relaxivity enhancement was found to be 100-168% in buffer with 1-3 equiv of Ca2+. The variation in the maximum relaxivity enhancement and the saturation equivalent might be due to their different Ca2+ binding affinity driven by their structural differences. These agents have also been tested for their Ca2+ selectivity in physiological relevant media such as artificial cerebrospinal fluid and artificial extracellular matrix. The promising in vitro results obtained with this series of agents proved their potential to be tested in vivo. However, to understand the functional activity in the brain, a detailed knowledge of anatomical connections between different brain regions would be extremely helpful. The second part of the thesis, therefore, dealt with the synthesis of the probes which can reveal the anatomical connectivity in the brain. A well known neuroanatomical tracer, Biocytin (Biotinyl-L-Lysine), was chosen as the model compound and structural modifications were done on it for connecting it to a MR detectable moiety. For this purpose, a novel precursor tris-tert-Bu-(Z)-Ser-DO3A was synthesized. Biotin and lysine were planned to be coupled to this precursor via the amine and carboxylate group, respectively. In parallel, another molecule (L10) with similar structure but without the MR detectable moiety was synthesized. The rational of synthesizing this molecule was to check if coupling biocytin in a two step manner i.e. coupling biotin and lysine independently affects the neuronal track tracing ability or not. The histological results showed that not only the track tracing ability was retained but higher stability, as compared to commercially available biocytin, was also gained. The novel synthesized precursor (tris-tert-Bu-(Z)-Ser-DO3A), was also explored for its potential application in MRI. Coupling biotin to this precursor and the final loading with Gd3+ resulted in a potential targeted CA, Gd-L12. This CA, when bound to avidin, showed an enhancement in the relaxivity (r1 and r2) at 1.5T. A substantial increase of more than 1000% in r2 was observed at all magnetic field studied (1.5T, 3T, 7T, 9.4T) while r1 showed an increase of 260% at 1.5T and an expected decrease with further increase of magnetic field strength. The relaxivity behavior at 1.5T suggests that the structural requirement of a CA to fit in the avidin cavity is matched well with Gd-L12. Also, the high relaxivity observed for Gd-L12-Avidin construct shows that the fine tuning of the structure of CA is a crucial factor in the optimization of relaxivity enhancement by binding to the protein.

Das langfristige Ziel der im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführten Projekte war die Darstellung der funktionellen Aktivität im lebenden Gehirn. Momentan verfügbare Methoden für solche Untersuchungen basieren auf der Messung hämodynamischer Veränderungen (z.B. die funktionelle Magnetresonanzbildgebung, fMRI) und können daher nur indirekt neurale Aktivität darstellen. Einen direkteren und präziseren Weg die funktionelle Aktivität des Gehirns abzubilden, stellt die Detektion von Faktoren dar, die unmittelbarer an die neurale Aktivität gekoppelt sind. Dazu zählen z.B. Membranpotential, pH-Wert, Ca2+, Na+, Cl-, und Neurotransmitter-Flüsse etc. Unter den verschiedenen Ionen-Flüssen wurde die von der neuronalen Aktivität abhängige Modulation der Ca2+ Konzentration intensiv mit Hilfe der optischen Bildgebung untersucht. Eine Vielzahl von Ca2+ sensitiven Fluoreszenzindikatoren, ursprünglich von Roger Tsien entwickelt, sind nun verfügbar, um die Rolle von Ca2+ in verschiedenen Signalwegen unter normalen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Allerdings leiden diese Techniken unter der Bildung von ausbleichenden Nebenprodukten, der Unfähigkeit Signale in tieferen Hirnstrukturen aufzuzeichnen und damit Vorgänge im gesamten Gehirn zu detektieren. Das Ziel ist, eine nicht-hemodynamische Methode zur Messung der Hirnaktivität zu entwickeln, die nicht durch geringe Eindringtiefe limitiert ist und damit die Möglichkeit bietet, das gesamte Gehirn zu betrachten. Dazu sollten MR detektierbare funktionelle Kontrastmittel entwickelt werden, die in der Lage sind Veränderungen der Ca2+ Konzentration in dynamischen MR Kontrast in der MR Bildgebung umzusetzen. Solche Verbindungen werden als „intelligente“ (smarte) Kontrastmittel (SCA) bezeichnet. Anders als beim Design von Wirkstoffen für Mikroinjektionen in die Zelle, entwickelten wir Agenzien, die in der Lage sein sollen extrazelluläres Ca2+ im Konzentrationsbereich von 1 – 2 mM zu detektieren. Dies erfordert ein Kontrastmittel, das einen Chelator mit niedriger Affinität zu Ca2+ enthält. Wir haben deshalb den bekannten starken Chelator für Ca2+, BAPTA, modifiziert und an zwei Gd-DO3A-Einheiten gekoppelt. Dadurch wurde ein Konstrukt erhalten, das eine niedrige Bindungsaffinität für Ca2+ aufweist. Eine Reihe von entsprechenden bis-makrozyklischen Kontrastmitteln wurde synthetisiert und charakterisiert. Die maximal erreichbare Erhöhung der Relaxivität (Relaxationsrate per mM Kontrastmittel), die mit diesen Verbindungen erhalten werden konnte, betrug jedoch nur 15% in Anwesenheit von 10 Äquivalenten Ca2+. Um die Sensitivität zu verbessern, wurden mono-makrozyklische Moleküle synthetisiert und charakterisiert, die auf dem niedrig-affinen Chelator APTRA basieren. Alle synthetisierten Vertreter dieser Reihe (Ln-L5-9), außer Ln-L6, zeigten eine exzellente Sensitivität für Ca2+. Die Zunahme der Relaxivität betrug 100-168% in Pufferlösungen in Anwesenheit von 1-3 Äquivalenten Ca2+. Die Unterschiede in der maximalen Erhöhung der Relaxivität und der benötigten Menge an Ca2+ bis zur Sättigung dieses Effektes könnte durch die strukturellen Unterschiede erklärt werden, die zu unterschiedlichen Ca2+ Bindungsaffinitäten führen. Diese Kontrastmittel wurden auch auf ihre Ca2+-Selektivität in physiologisch relevanten Medien wie z.B. Cerebrospinalflüssigkeit oder Extrazellulärmatrix untersucht. Die dabei erhaltenen vielversprechenden in vitro Ergebnisse zeigten ihr Potential um auch in vivo getestet zu werden. Für das Verständnis der funktionelle Aktivität im Gehirn ist das detaillierte Wissen über die anatomischen Verbindungen zwischen verschiedenen Hirnregionen extrem hilfreich. Daher handelt der zweite Teil der Arbeit von der Synthese von Kontrastmitteln, die diese anatomische Konnektivität aufzeigen sollen. Ein bekannter neuroanatomischer Tracer, Biocytin (Biotinyl-L-Lysin), wurde als Modellverbindung ausgesucht. Es wurden strukturelle Modifikationen eingeführt, um eine MR detektierbare Einheit anzuknüpfen. Dazu wurde eine neue Vorstufe, tris-tert-Bu-(Z)-Ser-DO3A, synthetisiert. Biotin sollte dann über die Amino-Gruppe und Lysin über das Carboxylat gekoppelt werden. Parallel dazu wurde ein weiteres Molekül (L10), mit vergleichbarer Struktur aber ohne MR-detektierbare Einheit, synthetisiert. Dieses Molekül wurde hergestellt, um zu überprüfen, inwieweit die Kopplung von Biocytin in einem Zweistufenprozess, d.h. die Kopplung von Biotin und Lysin unabhängig voneinander, die Fähigkeit neuronale Verknüpfungen darzustellen beeinflusst. Die Ergebnisse der histologischen Untersuchungen zeigten, dass nicht nur diese Eigenschaft erhalten blieb, sondern auch eine höhere Stabilität, verglichen mit dem kommerziell erhältlichen Biocytin, erzielt werden konnte. Die synthetisierte neuartige Vorstufe tris-tert-Bu-(Z)-Ser-DO3A wurde ebenfalls auf ihre mögliche Anwendung in der MR Bildgebung getestet. Die Verknüpfung von Biotin mit dieser Vorstufe und die nachfolgende Komplexierung von Gd3+ resultierten in dem potentiellen gezielten Kontrastmittel Gd-L12. Dieses zeigte einen Anstieg der Relaxivität (r1 und r2) bei 1.5T, wenn es an Avidin gebunden wurde. Eine erhebliche Zunahme von mehr als 1000% in r2 wurde bei allen untersuchten Magnetfeldstärken (1.5T, 3T, 7T, 9.4T) beobachtet, während r1 bei 1.5T einen Anstieg von 260% zeigte sowie mit steigenden Feldstärken die erwartete Abnahme. Das Verhalten der Relaxivität bei 1.5T lässt vermuten, dass in Gd-L12 die strukturellen Erfordernisse erfüllt sind, die an ein Kontrastmittel gestellt werden, um in die Bindungstasche des Avidin zu passen. Zudem zeigt die hohe Relaxivität, die für das Gd-L12-Avidin Konstrukt beobachtet wurde, dass die Feineinstellung der Struktur des Kontrastmittels einen kritischen Faktor bei der Optimierung der Relaxivitäts-Zunahme mit der Bindung ans Protein darstellt.