Mechanismen und Stereoselektivität der Ofloxacinpermeation durch Caco-2/TC7 Monolayer

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Aufklärung der endothelialen Transportmechanismen von Ofloxacin. Als in vitro Modell für das gastrointestinale Epithel steht der Subklon TC7 der Caco-2 Zelllinie zur Verfügung. Anhand von Permeationsstudien, die an Monolayern im Transwell®-Filterkammersystem durchgeführt werden, sollen die Mechanismen der Arzneistoffabsorption durch Variationen im Versuchsaufbau näher erforscht werden. Beim Gyrasehemmer Ofloxacin handelt es sich um ein chirales Molekül, bei dem die beiden Enantiomere Unterschiede in ihrer antibiotischen Wirkung aufweisen. Aus diesem Grund soll eine mögliche Stereoselektivität des epithelialen Arzneistofftransports untersucht werden. Mit Hilfe einer kapillarelektrophoretischen Methode ist es möglich, die beiden Ofloxacin-Enantiomere nebeneinander in einer Probe zu quantifizieren. Auf diese Weise werden die Permeationskoeffizienten der beiden Isomere für jedes durchgeführte Experiment getrennt voneinander ermittelt. Darüber hinaus wird die starke Sekretion, der Ofloxacin unterliegt, genauer betrachtet. Dabei stellt sich die Frage, welcher Anteil der Sekretion auf P-Glycoprotein zurückzuführen ist und ob möglicherweise weitere Efflux-Transporter mitwirken. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Transport von Ofloxacin in absorptiver Richtung. Ofloxacin zeigt trotz der starken Sekretion in vivo eine sehr gute Bioverfügbarkeit. Dies ist ein Hinweis auf mögliche Transporter, die in absorptiver Richtung den Transport unterstützen. Eine rein passive Permeabilität bei der vorliegenden starken Sekretion würde eine geringere Bioverfügbarkeit erwarten lassen. Zunächst wird der Einfluss unterschiedlicher Startkonzentrationen auf die Permeabilität von Ofloxacin untersucht. Die ermittelten Permeationskoeffizienten liegen im gesamten Konzentrationsbereich auf dem selben Niveau, wobei die Werte der Sekretion deutlich oberhalb der Werte der Absorption liegen. Dies deutet das Vorhandensein eines aktiven Sekretionsmechanismus an, dessen Kapazität im untersuchten Bereich allerdings nicht erschöpft wird. Durch den Einsatz der P-Glycoprotein Inhibitoren Verapamil und Chinidin ist es gelungen das Ausmaß dieser Efflux-Pumpe am Transport zu bestimmen. In Richtung der Absorption kann durch Experimente unter Energieentzug die Beteiligung aktiver Transportmechanismen ausgeschlossen werden. Mit Hilfe der Inhibitoren Probenecid und Naringin ist es jedoch gelungen einen Carrier zu identifizieren, der über erleichterte Diffusion den Transport von Ofloxacin unterstützt. Hinsichtlich der Stereoselektivität des untersuchten Mechanismus ergeben sich kleine, wenn auch nicht signifikante Unterschiede, die allerdings bei allen einzelnen Experimenten zu beobachten sind. So scheint die Absorption von Levofloxacin begünstigt zu sein. Die Tatsache, dass nach Blockade des stereounspezifischen Inhibitors P-Glycoprotein dieser Trend in Richtung Sekretion zu Gunsten des R-Enantiomers auftritt lässt die Vermutung zu, dass ein stereospezifischer Mechanismus zu Grunde liegt, der durch das stereounspezifische P-Glycoprotein sowie die hohe passive Permeabilität maskiert wird. Zusammenfassend lässt sich der ermittelte Transportmechanismus von Ofloxacin durch das Epithel folgendermaßen beschreiben: Ofloxacin unterliegt einer starken Sekretion, die sich zum Großteil, wenn nicht sogar komplett, durch P-Glycoprotein erklären lässt. Darüber hinaus zeigt es eine gute passive Permeabilität, die für den transmembranären Transport sicherlich eine wichtige Rolle spielt. Die Ofloxacin-Absorption wird zusätzlich durch verschiedene Carrier verstärkt, die im Sinne einer erleichterten Diffusion die Permeabilität von Ofloxacin durch die Membran erhöhen. Der organische Anionentransporter OATP1A2 kann als ein an der Ofloxacin-Absorption beteiligter Carrier identifiziert werden. Die Untersuchungen deuten das Vorhandensein eines stereoselektiven Transporters an, es kann letztlich aber kein signifikanter Unterschied im Ausmaß des Transports der beiden Enantiomere nachgewiesen werden. Dies ist sicherlich auf die Komplexität des Transportmechanismus zurückzuführen, der aus dem Zusammenspiel vieler einzelner Mechanismen resultiert.

Aim of this thesis is to elucidate the endothelial transport mechanism of ofloxacin. In vitro model for the gastrointestinal epithelial layer is the subclone TC7 of the Caco-2 cell line. Permeability studies are performed on monolayers grown in Transwell® filter inserts. By varying the setup of the experiments the involved mechanism for the transcellular transport can be clarified. The gyrase inhibiting agent ofloxacin is a chiral molecule with different antibiotic potencies for the two enantiomers. For this reason a stereoselective discrimination regarding epithelial transport mechanism of one of the enantiomers should be determined. A method with enantioselective capillary electrophoresis is providing the possibility to determine both enantiomers in one sample. Thus, experiments can be carried out with racemic ofloxacin and the permeability coefficients of two enantiomers are determined out of one experiment. Another aspect of the research concentrates on the strong secretion ofloxacin is subject to. The extend of the contribution of the efflux pump P-glycoprotein and a possible involvement of other efflux transporters is examined. Furthermore the transport in absorptive direction is investigated. Even ofloxacin is subject to strong secretion, it has a very good in vivo bioavailability. This indicates the participation of a carrier because sole passive diffusion could not compensate the strong secretion and would result in poor bioavailability. Testing the effect of different starting concentrations on the permeability of ofloxacin leads to permeability coefficients that are at the same level in the whole concentration range. Values for secretion are higher compared to those for absorption. This indicates the participation of an active efflux mechanism with a high capacity. Deploying the P-gp inhibitors verapamil and quinidine clarifies the importance of this efflux mechanism. Experiments carried out under ATP-depleted conditions are able to exclude the involvement of an active carrier in absorption. By means of the two inhibitors probenecid and naringin a carrier that promotes permeation with a facilitated diffusion mechanism can be detected. Regarding the stereoselectivity of the transport mechanism there are little differences which can be seen in all experiments. Absorption of levofloxacin seems to be favored. The fact that a difference in secretion occurs after inhibiting the stereounspecific P-glycoprotein preferring the R-enantiomer, leads to the assumption, that there is a stereospecific mechanism, which is covered by the high passive permeability and P-glycoprotein. Summarizing the results of the permeability studies, the possible transport mechanism of ofloxacin can be described as follows: ofloxacin is subject to strong secretion, which is mainly due to P-glycoprotein. Ofloxacin has a good passive permeability, playing a major role for the transport across epithelial cells. In addition, absorption is supported by different carriers, which enhance permeability by a facilitated passive diffusion mechanism. The organic anion-transporting polypeptide 1A2 (OATP1A2) can be identified as one carrier involved. The studies suggest the existence of a stereoselective transport mechanism, without leading to significant differences between the transported amounts of the two enantiomers. This is probably caused by the complexity of the transport mechanism, resulting from an interaction of many different mechanisms.