Selective analysis of specific HLA ligand repertoires: poxviral CD8+ T cell epitopes and phosphorylated HLA ligands of tumor cells

Abstract

Human leukocyte antigens (HLA) present protein-derived peptides to T lymphocytes. The knowledge of HLA ligands presented by certain types of cells (e.g., virus infected or cancer cells) allows for stating against which molecular compounds, so called epitopes, a T cell-based immune response may be directed. This thesis concentrated on the selective indentification of viral and phosphorylated HLA ligands by HPLC-coupled mass spectrometry. Peptides of viral origin are presented on HLA class I by virus-infected cells to CD8+ cytotoxic T cells (CTL), which kill the infected cell upon recognition. Phosphorylated HLA class I ligands have raised hope to play a role in the immune response to cancer, since cellular signaling, which is often altered in malignant cells, includes phosphorylation of proteins. Identification of viral or phosphorylated HLA ligands is challenging due to their low frequency and potential low abundance compared to that of self-ligands and non-phosphorylated peptides. A novel approach using differential stable isotope labeling of HLA ligands purified from infected and mock-infected cells was applied to identify naturally processed viral HLA ligands. The virus analyzed was modified vaccinia virus Ankara (MVA), which is currently being tested as recombinant and smallpox vaccine. 15 viral peptides of which twelve were presented by HLA-A*0201 and three by HLA-B*0702 were found. Nine peptides have not been described as CTL epitopes so far. All HLA-A*0201 ligands were actual memory CTL epitopes in MVA vaccinees. Eight of these epitopes were novel. All ligands were expressed early during the viral life cycle, although late protein synthesis was not impaired. Importantly, early viral HLA ligands mediated protection against a lethal respiratory challenge in mice while late viral peptides previously described as CTL epitopes were inefficient. Thus, knowledge of the peptides which are actually presented by infected cells is crucial for optimizing the monitoring of protective immune responses and for the development of effective peptide-based vaccines. In addition, this differential analyis revealed two human self-HLA ligands which were highly upregulated in the MVA-infected cells, suggesting either specifically induced synthesis and/or degradation of the source proteins upon infection. Both ligands were derived from cytoskeletal proteins. Unusually high presentation of self-ligands in association with infection might potentially induce self-reactive T cells playing a role in autoimmune responses observed during vaccinia virus vaccination. By developing TiO2-based microcentrifugation columns, the first phosphorylated HLA class I ligands presented by tumor tissue (renal cell carcinoma) were identified. By comparison to the ligands of healthy renal tissue one phosphorylated Brf1-derived HLA ligand was found as potentially tumor-associated. Moreover, the first natural phosphorylated HLA class II ligands were discovered. They revealed several novel phosphorylation sites of transmembrane receptors playing a significant role in malignant signaling, such as Frizzled 6, CXCR4 and CD20.

Humane Leukocyten-Antigene (HLA) präsentieren aus Proteinen stammende Peptide den T-Lymphocyten. Die Kenntnis von HLA-Liganden, die von bestimmten Zelltypen (z.B. Virus-infizierten oder Krebszellen) präsentiert werden, ermöglicht es Aussagen zu treffen, gegen welche molekularen Komponenten, so genannte Epitope, eine T-Zell-Antwort gerichtet sein kann. Fokus dieser Arbeit war die gezielte Identifizierung von viralen und phosphorylierten HLA-Liganden mittels HPLC-gekoppelter Massenspektrometrie. Peptide viralen Ursprungs werden von HLA Klasse I auf virus-infizierten Zellen den CD8+ cytotoxischen T-Zellen (CTL) präsentiert, die die infizierte Zelle nach Erkennung abtöten. Bezüglich phosphorylierten HLA Klasse I-Liganden besteht die Hoffnung, dass sie in der Immunantwort gegen Krebs eine Rolle spielen, da die zelluläre Signalweiterleitung, die in malignen Zellen oft gestört ist, Phosphorylierung von Proteinen umfasst. Die Identifizierung von viralen oder phosphorylierten HLA-Liganden ist dadurch erschwert, dass diese im Vergleich zu Liganden aus zelleigenen Proteinen und nicht-phosphorylierten Liganden in geringer Anzahl und möglicherweise auch Menge auftreten. Zur Identifizierung von natürlich prozessierten viralen HLA-Liganden wurde ein neuer Ansatz verfolgt, der auf der differenziellen Markierung von HLA-Liganden aus infizierten und nicht-infizierten Zellen mit stabilen Isotopen beruht. Bei dem untersuchten Virus handelte es sich um das Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA), das zurzeit als rekombinanter und Pocken-Impfstoff getestet wird. Es wurden 15 virale Peptide identifiziert, davon wurden zwölf auf HLA-A*0201 und drei auf HLA-B*0702 präsentiert. Neun dieser Peptide wurden zuvor noch nicht als T-Zell-Epitope beschrieben. Alle HLA-A*0201-Liganden erwiesen sich tatsächlich als CTL-Epitope in MVA-Impflingen. Acht dieser Epitope waren neu. Alle Liganden stammten aus Proteinen, die früh im viralen Lebenszyklus gebildet werden, und dies obwohl die späte Proteinsynthese nicht gehemmt war. Eine wichtige Beobachtung war, dass Mäuse durch Impfung mit frühen viralen HLA-Liganden gegenüber einer letalen eingeatmeten Viruslast geschützt waren, während späte Peptide, die zuvor als CTL-Epitope beschrieben worden waren, diesen Schutz nicht boten. Um den Verlauf von schützenden Immunantworten optimal zu überwachen und um effektive Peptid-basierte Impfstoffe zu entwickeln, ist es also unverzichtbar, die Peptide, die tatsächlich von infizierten Zellen präsentiert werden, zu kennen. Durch diese differenzielle Analyse wurden zusätzlich zwei humane HLA-Liganden gefunden, die auf den MVA-infizierten Zellen stark überpräsentiert waren, was darauf hinweist, dass die Proteine, aus denen diese HLA-Liganden stammten, durch die Infektion hervorgerufen verstärkt synthetisiert und/oder abgebaut wurden. Beide Liganden stammten aus Proteinen des Cytoskeletts. Ungewöhnlich starke Präsentation von Liganden körpereigener Proteine in Verbindung mit einer Infektion könnte selbst-reaktive T-Zellen aktivieren, die eine Rolle in den Autoimmunreaktionen spielen könnten, die bei Impfungen mit dem Vaccinia Virus aufgetreten sind. Mittels selbst entwickelter TiO2-Mikrozentrifugationssäulchen gelang es, die ersten phosphorylierten HLA Klasse I-Liganden aus Tumorgewebe (des Nierenzellcarcinoms) zu identifizieren. Durch den Vergleich mit Liganden, die aus gesundem Nierengewebe identifiziert wurden, wurde ein phosphorylierter HLA-Ligand aus dem Protein Brf1 gefunden, der möglicherweise in Verbindung mit dem Tumorwachstum stehen könnte. Außerdem wurden die ersten endogenen phosphorylierten HLA Klasse II-Liganden entdeckt. Sie enthielten einige bisher nicht bekannte Phosphorylierungs-stellen von Transmembranrezeptoren, die eine bedeutende Rolle in der Signal-transduktion von Krebszellen spielen, wie zum Beispiel Firzzled 6, CXCR4 und CD20.