Metabolomics in der Tumordiagnostik: Massenspektrometrische Untersuchungen zum metabolischen Profil modifizierter Nucleoside

Abstract

Die Forschung nach neuartigen Markersubstanzen für die Früherkennung und die Therapiekontrolle von Krebserkrankungen ist von großer klinischer Relevanz, da die gegenwärtig eingesetzten Tumormarker zumeist nur unbefriedigende Sensitivitäts- und Spezifitätswerte aufweisen. Neben der Untersuchung des genomischen Profils (Genomics) und des exprimierten Proteinmusters (Proteomics) rücken hierbei zunehmend auch die Bestandteile des Metaboloms, also die Stoffwechsel-Endprodukte eines biologischen Systems, in den klinischen Fokus.

Eine Metabolitenklasse, die nachhaltig im Zusammenhang mit möglichen neuartigen Tumormarkern genannt wird, ist die der modifizierten Nucleoside. RNA enthält neben den regulären Ribonucleosiden eine Reihe strukturell veränderter Analoga. Modifikationen wie Methylierungen, Hydroxylierungen, Acetylierungen, Isomerisierungen und die Addition komplexer Seitenketten werden posttranskriptional auf makromolekularer Ebene eingeführt. Nach dem enzymatischen Abbau der RNA werden die modifizierten Nucleoside als biochemische Endprodukte aus der Zelle über die Blutbahn und letztlich mit dem Urin ausgeschieden. Aufgrund des gestörten Zellstoffwechsels in Tumorgewebe erfolgt diese Ausscheidung in teilweise stark erhöhten Konzentrationen, was sich in charakteristischen Alterationen im metabolischen Profil niederschlägt. Infolge des Netzwerkcharakters von Stoffwechselwegen kann dieses Phänomen auch Auswirkungen auf das Ausscheidungsmuster von Metaboliten aus der biochemischen Peripherie des zellulären RNA-Metabolismus haben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das metabolische Profil von modifizierten Nucleosiden und biochemisch verknüpften Stoffwechselprodukten mit verschiedenen massenspektrometrischen Techniken analysiert. Es wurden Methoden zur affinitätschromatographischen Aufreinigung der genannten Stoffklasse entwickelt und die Anwendung auf verschiedene biologische Flüssigkeiten und Matrizes (Urin, Zellkulturüberstände, Blutplasma, Gewebe) optimiert. Für die gezielte Identifizierung bislang unbekannter Metabolite wurde eine selektive Methode zur Isolierung ribosylierter Verbindungen aus 24h-Urin von Tumorpatienten entwickelt. Die extrahierten Stoffwechselprodukte wurden anschließend mit IT-MSn und FT-ICR-MS analysiert. Aus den kombinierten massenspektrometrischen Daten mit charakteristischen Fragmentierungsmustern und Summenformelvorschlägen konnten insgesamt 23 Strukturen identifiziert werden, darunter zehn neue, d.h. bislang nicht in der Literatur beschriebene Urinmetaboliten sowie vier erstmals im Urin nachgewiesene Ribonucleoside. Neben dem zentral untersuchten RNA-Metabolismus wurden auch ribosylierte Komponenten aus verknüpften Stoffwechselwegen wie der Purin-Biosynthese, dem Histidin-Metabolimus, dem Polyamin / Methionin-Zyklus sowie dem Nicotinat / Nicotinamid-Metabolismus gefunden. Über LC-IT-MS-Analytik von Zellkulturüberständen wurde das Exkretionsmuster in Brustkrebszellen (MCF-7) und Brustepithelzellen (MCF-10A) verglichen. Es ergaben sich charakteristische Unterschiede bei der Ausscheidung bestimmter Metabolite, die auf pathophysiologische Mutationen und die resultierende Zellantwort zurückgeführt werden konnten. In einer weiteren klinischen Studie wurde das Potential des Ausscheidungsmusters selektierter ribosylierter Metabolite im Urin zur Klassifizierung von Brustkrebspatientinnen evaluiert. Hierzu wurde das metabolische Profil in Urinproben von 85 Mammakarzinompatientinnen und 85 gesunden Kontrollprobandinnen mit LC-IT-MS-Messungen analysiert und semiquantitativ ausgewertet. Anschließend erfolgte die bioinformatische Mustererkennung mittels Support Vector Machine (SVM). Hierbei wurde nicht wie üblicherweise auf Absolutkonzentrationen einzelner Komponenten als Eingabedaten zurückgegriffen, sondern Metabolitenverhältnisse analysiert. Aufgrund biochemischer Verknüpfungen in den untersuchten Stoffwechselwegen entstehen zwischen bestimmten Substraten Abhängigkeiten, die sich in tumorassoziierten Verschiebungen in einzelnen, von der SVM selektierten Verhältnissen wiederspiegelten. Im analysierten Testkollektiv konnte auf diese Weise eine Sensitivität von 83,5% und eine Spezifität von 90,6% mit 59 Metabolitkombinationen erreicht werden. Das Klassifizierungspotential konnte hierbei im Vergleich zu etablierten Brustkrebsmarkern wie CEA und CA 15-3 deutlich gesteigert werden. Die erhaltenen Ergebnisse können somit zur Etablierung eines verbesserten, nicht-invasiven Diagnosesystems beim Mammakarzinom beitragen.

The clinical research for novel biomarkers in early diagnosis and therapy surveillance of cancer diseases is a rapidly emerging field since many of the presently applied marker compounds show only unsatisfactory prediction values. Besides the analysis of the genomic profile (genomics) and the expressed protein pattern (proteomics), the metabolome, represented by the biochemical endproducts of a biological system, gains increasing interest.

Metabolites, often discussed as potential tumormarkers are the so-called modified nucleosides. In addition to the regular ribonucleosides, RNA contains a series of derived modified analogs. Modifications like methylation, hydroxylation, acetylation, isomerization and the addition of more complex side chains are posttranscriptionally implemented on the macromolecular level. After enzymatic degradation of RNA, the modified nucleosides are excreted as biochemical endproducts from the cell in the bloodstream and finally in the urine. Due to the altered cellular metabolism in tumor tissue, higher excretion rates can be observed, resulting in characteristic alterations in the metabolic profile. Considering the network characteristics in metabolism, the described phenomenon can also influence the excretion pattern of compounds, originating from pathways interconnected to the cellular RNA metabolism.

In the present work, the metabolic profile of modified nucleosides and related metabolites were analyzed with several mass spectrometric techniques. Methods for the isolation of the mentioned compound class with affinity chromatography were developed and optimized for their application on different biological fluids and matrices (urine, cell culture supernatants, blood, tissue). For the identification of yet unknown metabolites, a selective method for the isolation of ribosylated compounds from 24h urine of tumor patients was established. The isolated metabolites were subsequently analyzed via IT-MSn and FT-ICR-MS. Combining the obtained mass spectrometric information with characteristic fragmentation patterns and molecular formula suggestion, 23 structures could be identified. Ten metabolites turned out to be novel urinary compounds, which have not been described previously in literature. Additionally, the occurrence of four modified nucleosides in human urine was verified by mass spectrometry for the first time. Besides compounds from the primarily analyzed RNA metabolism, metabolites originating from interconnected pathways like the purine biosynthesis, the histidine metabolism, the methionine / polyamine cycle as well as from the nicotinate / nicotinamide metabolism were also detected.

The excreted metabolic profiles of breast cancer cells (MCF-7) and breast epithelial cells (MCF-10A) were compared in the corresponding cell culture supernatants by means of LC-IT-MS analysis. Characteristic differences were observed in the excretion of certain metabolites, which could unambiguously be attributed to pathophysiological mutations and the resulting cell response.

The breast cancer classification potential of the excreted profile of urinary ribosylated metabolites was evaluated in another clinical study. Therefore, the metabolic profile in urine samples from 85 breast cancer patients and 85 healthy volunteers was analyzed via semiquantitative LC-IT-MS measurements. The obtained values were subsequently analyzed with bioinformatic pattern recognition via support vector machine (SVM). Instead of comparing absolute concentration values as input data, pairwise encoded metabolite ratios were used. Due to the biochemical interconnectivity of the considered metabolic pathways, dependencies are created between certain substrates. These dependencies were reflected by tumor-associated shifts of certain metabolite ratios, selected by the SVM algorithm. With the developed method, a sensitivity of 83.5% and a specifity of 90.6% were achieved with 59 metabolite ratios in the analyzed test collective. This means a considerable improvement of the classification potential, compared to currently applied breast cancer markers like CEA and CA 15-3. The obtained results may contribute to the development of a reliable, non-invasive biomarker system for the diagnosis of breast cancer diseases.