Proteolytic shedding of NKG2D ligands from tumour cells

Abstract

The immunoreceptor NKG2D promotes immunosurveillance of malignant cells and protects the host from tumour initiation by activating NK cells and costimulating CD8 T cells. MICA and other ligands of NKG2D are frequently expressed by tumour cells. Human tumour cells are thought to avert NKG2D-mediated-immunosurveillance by shedding MICA and other NKG2D ligands (NKG2DL). This thesis shows that the GPI-anchored NKG2DL ULBP2 is released from the cell surface of tumour cells by the action of metalloproteases similarly to the type I transmembrane proteins MICA and MICB. In addition, soluble ULBP2 was detected in the serum of patients with hematopoetic malignancies. Shedding of MICA and ULBP2 from tumours was induced by activation of protein kinase C (PKC) and was inhibited by the same compounds suggesting that ULBP2 and MIC molecules are released by the same or closely related proteases. Further, the molecular mechanisms of MICA shedding were defined to characterise the proteases involved. Amino acid deletions in the membrane-proximal stalk region of the MICA ectodomain greatly impaired MICA shedding, whereas amino acid substitutions had no significant effect. Further, MICA shedding was blocked by specific inhibitors of “a disintegrin and metalloprotease” (ADAM) proteases and was markedly reduced when ADAM10 and/or ADAM17 were down-regulated by RNA-interference. Altogether, these data demonstrate that ADAM10 and ADAM17 are critically involved in the proteolytic release of soluble MICA by tumours and thereby likely contribute to tumour immune evasion. Therefore, therapeutic blockade of ADAM10 and ADAM17 activities may represent a novel attractive approach to improve the efficacy of immunotherapeutic cancer treatment.

NKG2D ist ein aktivierender NK-Zell Rezeptor und ein kostimulierender Rezeptor auf CD8 T Zellen. Die Expression der NKG2D Liganden (NKG2DL) wird durch Zellstress, virale Infektion und im Zuge maligner Transformation induziert und ermöglicht so dem Immunsystem die Erkennung und Elimination von veränderten und potentiell „gefährlichen“ Körperzellen (z. B. Tumoren). Die Freisetzung von löslichen NKG2D Liganden durch Metalloproteasen wird als ein wichtiger Mechanismus der Tumorzellen zur Vermeidung einer Immunantwort erachtet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch der NKG2DL ULBP2, wie z. B. die MIC-Moleküle MICA und MICB, in löslicher Form von der Zelloberfläche von Tumorzellen freigesetzt wird. Lösliches ULBP2 konnte im Serum von Leukämie-Patienten nachgewiesen werden. Die Tumor-assoziierte Freisetzung sowohl von ULBP2 als auch von MICA ließ sich durch Aktivierung der Protein Kinase C verstärken und durch die gleichen Inhibitoren blockieren. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass sowohl die MIC Moleküle als auch ULBP2, als Vertreter der GPI-verankerten ULBPs, durch die gleichen oder nah verwandte Proteasen freigesetzt werden. Zur Identifizierung dieser Proteasen wurde beispielhaft der NKG2D Ligand MICA gewählt. Es konnte gezeigt werden, dass MICA in der Stielregion, die sich zwischen der Transmembranregion und der Ektodomäne befindet, gespalten wird. Wichtig für die Freisetzung ist nicht die Aminosäuresequenz, sondern die Länge dieser Stielregion. Des Weiteren konnte die Bildung von löslichem MICA durch Inhibitoren, die spezifisch gegen Mitglieder der ADAM (eine Disintegrin und Metalloprotease) Proteasen gerichtet sind, verringert werden. Die aufgrund dieser Experimente getätigte Annahme, dass ADAM10 und ADAM17 an der Freisetzung von löslichem MICA beteiligt sind, konnte in zwei unabhängigen Versuchsansätzen durch transiente Expressionssuppression dieser ADAMs in zwei Tumorzelllinien bestätigt werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Metalloproteasen ADAM10 und ADAM17 an der Freisetzung von löslichem MICA von Tumorzellen beteiligt sind und somit einen interessanten Ansatzpunkt zur Verbesserung der Immuntherapien von Tumoren bieten.