Untersuchungen zur Bedeutung der Sulfonylharnstoffrezeptoren für die spezifische Induktion von Apoptose nach Behandlung mit Glibenclamid oder Resveratrol

Abstract

Der Sulfonylharnstoffrezeptor SUR1 ist die regulatorische Untereinheit der pankreatischen ATP-sensitiven K+-Kanäle (KATP Kanäle), welche eine wichtige Rolle bei der Auslösung der Insulinsekretion über Membrandepolarisation spielen. Sulfonylharnstoffe wie Glibenclamid blockieren den KATP Kanal und werden bei der Behandlung von Typ-II-Diabetes verwendet. Diese Substanz kann unter bestimmten Bedingungen Apoptose der pankreatischen b-Zellen induzieren. Die genauen molekularen Mechanismen der durch Sulfonylharnstoffe induzierten Apoptose sind noch unbekannt. Um die Rolle des SUR bei der Induktion von Apoptose zu überprüfen, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen der sulfonylharnstoffinduzierten Apoptose und den Sulfonylharnstoffrezeptoren besteht. Hierzu wurden rekombinanten HEK293-Zellen, welche entweder SUR1 oder SUR2B exprimierten, analysiert. Außerdem wurde die Bedeutung der Mutation M1289T in SUR1 untersucht. Bei dieser Mutation handelt es sich um eine Punktmutation in der Transmembranhelix 17 (TM17) des SUR1 an der Position 1289. An dieser Stelle wurde eine Aminosäure des SUR1 (Methionin) durch die korrespondierte Aminosäure bei SUR2B (Threonin) ausgetauscht. Durch die Untersuchung von verschiedenen apoptotischen Parametern (Quantifizierung der Zellablösung, Nachweis von Zellkernkondensierung und Fragmentierung und Bestimmung der Caspase-3-Aktivität) konnte nachgewiesen werden, dass die Expression von SUR1 die spezifische Induktion von Apoptose durch Glibenclamid verstärkt. Bei allen getesteten Parametern zeigten SUR1-Zellen verglichen mit SUR2B-, SUR1(M1289T) oder pcDNA-Kontroll-Zellen gesteigerte Apoptose. Die Coexpression von SUR1 mit der porenbildenden Untereinheit Kir6.2 veränderte den apoptotischen Effekt von Glibenclamid nicht signifikant. Daraus kann geschlossen werden, dass SUR1 im Gegensatz zu SUR2B oder SUR1(M1289T) den Zellen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber der durch Glibenclamid induzierten Apoptose verleiht. SUR1 als pankreatisches Protein könnte daher möglicherweise spezifisch an einer adaptiven Variation der b-Zell-Masse beteiligt sein und auf diese Weise zur Regulation der Insulinsekretion beitragen. Der vorliegenden Arbeit zufolge ist die TM17 an der SUR1-vermittelten Verstärkung der glibenclamidinduzierten Apoptose beteiligt. Die glibenclamidinduzierte Apoptose erfordert nicht die Anwesenheit der pankreatischen Kir6.x-Untereinheit und somit auch nicht das Vorliegen funktionsfähiger SUR1/Kir6.2 KATP Kanäle. Diese Tatsache weist auf eine zusätzliche, bisher noch unbekannte Funktion von SUR hin. Ergänzend konnte im Rahmen meiner Arbeit gezeigt werden, dass trans-Resveratrol, wie Glibenclamid Apoptose in HEK 293-Zellen induzieren kann. Dabei ist der Resveratrol-Effekt viel intensiver als der durch Glibenclamid ausgelöste Effekt. Bei der gleichen Substanzkonzentration von 100 µM ist der Resveratrol-Effekt bereits nach 24 Stunden deutlich zu beobachten. Der apoptotische Effekt von Resveratrol ist in rekombinanten SUR1-Zellen verglichen mit SUR2B-, SUR1(M1289T)- oder pcDNA-Zellen deutlich verstärkt. Dieses haben die Ergebnisse der Quantifizierung der Zellablösung, des Nachweises von Zellkernkondensierung und Fragmentierung und die Messung der Aktivität verschiedener Caspasen (Csp) gezeigt. Die zusätzliche Expression von Kir6.2 in SUR1-exprimierenden HEK 293-Zellen beeinflusst die resveratrolinduzierte Apoptose nicht. Dieses lässt darauf schließen, dass der komplette SUR1/Kir6.2-KATP-Kanal für die Induktion von Apoptose durch Resveratrol nicht zwingend erforderlich ist. Experimente mit SUR1-Knockout-Mäusen zeigen in isolierten pankreatischen Inseln ohne SUR1-Expression keine Anzeichen für Apoptose. Im Gegensatz dazu weisen die Inseln der Wildtyp-Mäuse typische Merkmale für Apoptose auf, wie zum Beispiel deutliche Zellkernfragmentierungen. Weitere Belege für einen Zusammenhang zwischen der verstärkten resveratrolinduzierten Apoptose und der Expression von SUR1 zeigen Untersuchungen an klonalen SUR1-exprimierenden b-Zelllinien (HIT-T15 und RIN-m5F) und an SUR2B-exprimierenden A10-Zellen. Nach der Behandlung mit Resveratrol wurden im Gegensatz zur Gefäßmuskel-Zelllinie A-10 deutliche apoptotische Merkmale bei den b-Zelllinien beobachtet. Ein SUR1-spezifischer Effekt konnte hingegen nach Behandlung mit dem klassischen Apoptose-Induktor Etoposid weder in rekombinanten HEK 293-Zellen noch in den klonalen b-Zelllinien festgestellt werden. Die Untersuchungen an verschiedenen SUR-Mutanten haben gezeigt, dass ebenso wie bei Glibenclamid die Mutation M1289T in Transmembranhelix 17 des SUR1 die für SUR1 typische Überempfindlichkeit gegenüber der Resveratrol-Behandlung vollständig aufhebt. Bei der Mutation T1254M in Transmembranhelix 17 des SUR2B wurde Threonin an der entsprechenden Position durch die korrespondierende SUR1-Aminosäure Methionin ausgetauscht. Diese Mutation konnte allerdings umgekehrt den SUR1-spezifischen Effekt von Resveratrol in SUR2B-Zellen nicht hervorrufen. Ergänzend wurde eine weitere Mutation in Transmembranhelix 17 des SUR1 auf die Resveratrolwirkung hin untersucht. In diesem Fall handelt es sich um eine SUR1-Mutation, bei der ein in der Familie der ABC-Proteine hochkonservierter Tryptophanrest an der Stelle 1296 durch Alanin substituiert wurde. Die Mutation des Tryptophanrestes an Position 1296 bei SUR1 bzw. 1261 bei SUR2B durch Alanin führt zu deutlichen Veränderungen in den Glibenclamid-Bindungseigenschaften, ohne dabei die Bindungseigenschaften verschiedener KATP-Kanalöffner zu beeinflussen. Auch durch diese Mutation wurde der SUR1-spezifische Resveratrol-Effekt unterdrückt. Dieses Ergebnis belegt erneut, dass TM17 eine bedeutende Rolle bei dem SUR1-spezifischen Effekt von Resveratrol spielt. In Verdrängungsversuchen mit [3H]-Glibenclamid konnte gezeigt werden, dass sich Resveratrol an SUR1 binden kann. Die Ergebnisse der Bindungsexperimente an SUR1 und SUR2B sowie an den Mutanten SUR1(S1238Y) und SUR2B(Y1206S) weisen darauf hin, dass die Bindungsstelle des SUR für Resveratrol zumindest zum Teil mit der Glibenclamid-Bindungsstelle identisch ist bzw. dass eine enge Kopplung zwischen den Bindungsstellen für beide Substanzen vorhanden ist. Bezüglich der molekularen Mechanismen der SUR1-spezifischen resveratrolinduzierten Apoptose liefert die spezifisch erhöhte Csp-9-Aktivität in SUR1-Zellen erste Hinweise auf eine Beteiligung des mitochondrialen apoptotischen Weges. Die Untersuchungen anderer Csp, wie zum Beispiel Csp-8 und Csp-12, haben ergeben, dass die über Todesrezeptoren und ER-Stress vermittelten Wege wahrscheinlich nicht an der SUR1-spezifischen resveratrolinduzierten Apoptose beteiligt sind.

Sulfonylurea receptor 1 (SUR1) is the regulatory subunit of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel (KATP channel), which is essential for triggering insulin secretion via membrane depolarization. Sulfonylureas, such as glibenclamide and tolbutamide, act as KATP channel blockers and are widely used in diabetes treatment. These antidiabetic substances are known to induce apoptosis in pancreatic beta-cells or beta-cell lines under certain conditions. However, the precise molecular mechanisms of this sulfonylurea-induced apoptosis are still unidentified. To investigate the role of SUR in apoptosis induction, we tested the effect of glibenclamide on recombinant human embryonic kidney 293 cells expressing either SUR1, the smooth muscular isoform SUR2B, or the mutant SUR1(M1289T) at which a single amino acid in transmembrane helix 17 (TM17) was exchanged by the corresponding amino acid of SUR2. By analyzing cell detachment, nuclear condensation, DNA fragmentation, and caspase-3-like activity, we observed a SUR1-specific enhancement of glibenclamide-induced apoptosis that was not seen in SUR2B, SUR1(M1289T), or control cells. Coexpression with the pore-forming Kir6.2 subunit did not significantly alter the apoptotic effect of glibenclamide on SUR1 cells. In conclusion, expression of SUR1, but not of SUR2B or SUR1(M1289T), renders cells more susceptible to glibenclamide-induced apoptosis. Therefore, SUR1 as a pancreatic protein could be involved in specific variation of beta-cell mass and might also contribute to the regulation of insulin secretion at this level. According to our results, TM17 is essentially involved in SUR1-mediated apoptosis. This effect does not require the presence of functional Kir6.2-containing KATP channels, which points to additional, so far unknown functions of SUR.

SUR binds nucleotides and synthetic KATP channel modulators, e.g. the antidiabetic sulfonylurea glibenclamide, which acts as a channel blocker. However, knowledge about naturally occurring ligands of SUR is very limited. In this study, we show that the plant phenolic compound trans-resveratrol can bind to SUR and displace binding of glibenclamide. Electrophysiological measurements revealed that resveratrol is a blocker of pancreatic SUR1/Kir6.2 KATP channels. We further demonstrate that, like glibenclamide, resveratrol induces enhanced apoptosis. This was shown by analyzing different apoptotic parameters (cell detachment, nuclear condensation and fragmentation, and activities of different caspase enzymes). The observed apoptotic effect was specific to cells expressing the SUR1 isoform and was not mediated by the electrical activity of KATP channels, as it was observed in human embryonic kidney 293 cells expressing SUR1 alone. Enhanced susceptibility to resveratrol was not observed in pancreatic beta-cells from SUR1 knock-out mice or in cells expressing the isoform SUR2A or SUR2B or the mutant SUR1(M1289T). Resveratrol was much more potent than glibenclamide in inducing SUR1-specific apoptosis. Treatment with etoposide, a classical inducer of apoptosis, did not result in SUR isoform-specific apoptosis. In conclusion, resveratrol is a natural SUR ligand that can induce apoptosis in a SUR isoform-specific manner. Considering the tissue-specific expression patterns of SUR isoforms and the possible effects of SUR mutations on susceptibility to apoptosis, these observations could be important for diabetes and/or cancer research.