Principles of stable isotope fractionation during anaerobic respiration

Abstract

The measurements of stable isotope ratios in sulfate and nitrate have proven to be extremely useful for identification and quantification of microbial processes in the environment. Bacterial sulfate reduction as well as denitrification is accompanied by a fractionation of the stable isotopes of the respective electron acceptor leading to an enrichment of the heavier isotope in the remaining fraction. The main objective of this study was to contribute to the fundamental understanding of anaerobic reduction processes and the related isotope effects in the residual sulfate and nitrate. Therefore, experiments on sulfate reduction and denitrification were performed with pure cultures. The dual isotope approach (O, S/N) was used to elucidate the influences on the oxygen isotope fractionation, as well as to explain the high variability of sulfur and nitrogen isotope enrichment during the respective respiration processes. Hence, the findings of this study on a microscale help to understand and to quantify these processes on a macroscale. The present thesis includes three chapters and the intention, the used approach and the results of each chapter is briefly summarized below:

CHAPTER 1: STABLE ISOTOPE FRACTIONATION DURING BACTERIAL SULFATE REDUCTION IS CONTROLLED BY REOXIDATION OF INTERMEDIATES

Basic principles in stable isotope fractionation of sulfur and a suggested oxygen isotope exchange between residual sulfate and water during bacterial sulfate reduction were investigated by a systematic study. Batch experiments with four sulfate-reducing strains (Desulfovibrio desulfuricans, Desulfobacca acetoxidans, Desulfonatronovibrio hydrogenovorans, and strain TRM1) were performed. These microorganisms metabolize different carbon sources (lactate, acetate, formate, and toluene) and show broad variations in their sulfur isotope enrichment factors. The experiments were conducted with 18O-enriched (delta18Owater = + 700 permil) and -depleted water (delta180water = - 40 permil), respectively and the stable isotope shifts of oxygen in the residual sulfate were followed. For Desulfovibrio desulfuricans and Desulfonatronovibrio hydrogenovorans, which are both characterized by low sulfur isotope fractionation (epsilonS equal to or higher than - 13.2 permil), delta18O values in the remaining sulfate increased by only 50 permil during growth when 18O-enriched water was used for the growth medium. In contrast, with Desulfobacca acetoxidans and strain TRM1 (epsilonS equal to or less than - 22.7 permil) the residual sulfate showed an increase of the delta18O close to the values of the enriched water of + 700 permil. In the experiments with 18O-depleted water, the oxygen isotope values in the residual sulfate remained fairly constant for strains Desulfovibrio desulfuricans, Desulfobacca acetoxidans and Desulfonatronovibrio hydrogenovorans. However, strain TRM1, which exhibits the most negative sulfur isotope enrichment factor (epsilonS equal to or less than - 38.7 permil) showed slightly decreasing delta18O values. The results give strong evidence that the oxygen atoms of sulfate are exchanged with the one from ambient water during sulfate reduction. However, this neither takes place in the sulfate itself nor during formation of APS (adenosine-5-phosphosulfate), but rather in intermediates of the sulfate reduction pathway. These may be partially reoxidized to form sulfate. This reoxidation in turn leads to an incorporation of oxygen from water into the “recycled” sulfate changing the overall 18O isotopic composition of the remaining sulfate fraction. The study shows that such incorporation of 18O is correlated with the stable isotope enrichment factor for sulfur measured during sulfate reduction. The reoxidation of intermediates of the sulfate reduction pathway does also strongly influence the sulfur stable isotope enrichment factor and is probably dependent on the metabolic conversion of the substrate and therefore indirectly influences the stable isotope fractionation factor in a rate dependent manner.

CHAPTER 2: EFFECTS OF NITRITE ON STABLE ISOTOPE FRACTIONATION DURING BACTERIAL SULFATE REDUCTION

This work supports the findings of the previous chapter. In batch experiments with 18O-enriched water the effect of different nitrite concentrations on sulfur isotope fractionation by Desulfovibrio desulfuricans was investigated. With increasing nitrite concentrations, the sulfur isotope enrichment factors also became more negative from - 12 to - 25 permil. Furthermore, the delta18O values in the remaining sulfate increased from approximately 50 to 120 permil when 18O-enriched water was supplied. Since 18O exchange with ambient water does not take place in sulfate itself, but rather in intermediates of the sulfate reduction pathway (e.g. SO32-), it is suggested that nitrite affects the steady-state concentration and the extent of reoxidation of the metabolic intermediate sulfite to sulfate during sulfate reduction. Given that nitrite is known to inhibit the production of the enzyme dissimilatory sulfite reductase, the results suggest that the activity of this enzyme regulates the kinetic isotope fractionation of sulfur and oxygen during bacterial sulfate reduction. These novel results also imply that isotope fractionation during bacterial sulfate reduction strongly depends on the cell internal enzymatic regulation rather than on the physico-chemical features of the individual enzymes.

CHAPTER 3: STABLE ISOTOPE FRACTIONATION DURING DENITRIFICATION BY STRAIN THAUERA AROMATICA

For the better understanding of biogeochemical regulators we studied stable isotope fractionation during denitrification in a series of batch experiments with strain Thauera aromatica. The experiments were conducted under anoxic conditions with two different carbon sources, acetate and toluene, and oxygen isotope labeled water (delta18Owater~ + 700 permil) to observe putative oxygen isotope exchange reactions of nitrate with water. The experiments with acetate as sole carbon source produced isotope enrichment factors for nitrogen (delta15N) are around - 14 permil, whereas the isotope enrichment factors for nitrogen (delta15N) in the residual nitrate when toluene was the electron donor are around - 20 permil. Furthermore, the delta18O values of nitrate were fairly constant during the latter experiment, although oxygen isotope labeled water was added to the growth medium. The results presented here suggest that the type of the carbon source indirectly influences the nitrogen isotope fractionation during denitrification by Thauera aromatica. Furthermore, the experiments with labeled water give no indication that the oxygen isotopes of residual nitrate are influenced by oxygen isotope exchange with water and a subsequent reoxidation of metabolic intermediates such as nitrite. These findings are important for a quantitative assessment of in situ denitrification rates since the experiments demonstrate that generally high fractionations during denitrification can be found in environments where complex substrates such as aromatic compounds and more refractory substrates are oxidized.

Die Ermittlung von stabilen Isotopenverhältnissen im Sulfat und Nitrat haben sich als äusserst hilfreiches Mittel zur Identifikation und Quantifizierung von mikrobiellen Prozessen erwiesen. Sowohl die bakterielle Sulfatreduktion als auch die Denitrifikation werden von einer Fraktionierung der stabilen Isotope des jeweiligen Elektronenakzeptors begleitet, was eine Anreicherung der schwereren Isotope in der residualen Fraktion zur Folge hat. Gemeinsames Ziel dieser Arbeit ist, zu dem fundamentalen Verständnis anaerober Reduktionsprozesse und deren zugehörigen Isotopeneffekten im residualen Sulfat und Nitrat beizutragen. Aus diesem Grund wurden Experimente zur Sulfatreduktion und Denitrifikation mit Reinkulturen durchgeführt. Der Ansatz, beide Isotopen (O, S/N) zu analysieren wurde verwendet, um eine Beeinflussung der Isotopenfraktionierungen im Sauerstoff zu klären, sowie die hohe Variabilität der Isotopenanreicherungen während der jeweiligen Respirationsprozesse zu deuten. Daher helfen die Erkenntnisse dieser Arbeit auf der Mikroskala diese Prozesse auf einer Makroskala besser verstehen und quantifizieren zu können. Die vorliegende Doktorarbeit ist in drei Chaptere gegliedert, die Zielsetzung, der angewandte Arbeitsansatz und die Ergebnisse jeder einzelner Arbeit werden im Folgenden kurz zusammengefasst.

KAPITEL 1: KONTROLLE DER STABILEN ISOTOPENFRAKTIONIERUNG WÄHREND DER BAKTERIELLEN SULFATREDUKTION DURCH DIE REOXIDATION VON INTERMEDIATEN

In einer systematischen Studie wurden grundlegende Prinzipien der stabilen Isotopenfraktionierung und ein möglicher Sauerstoffisotopenaustausch zwischen residualem Sulfat und umgebendem Wasser untersucht. Batch-Experimente wurden mit vier sulfatreduzierenden Kulturen (Desulfovibrio desulfuricans, Desulfobacca acetoxidans, Desulfonatronovibrio hydrogenovorans und Stamm TRM1) durchgeführt. Diese Mikroorganismen metabolisieren jeweils verschiedene Kohlenstoffquellen (Lactat, Acetat, Formiat und Toluol) und zeigen ein breites Spektrum an Anreicherungsfaktoren der Schwefelisotope. Die Experimente wurden jeweils in 18O-angereichertem (delta18OWasser = + 700 Promill) und -abgereichertem Wasser (delta18OWasser = - 40 Promill) durchgeführt und die stabilen Isotopenverschiebungen im Sauerstoff beobachtet. Bei Desulfovibrio desulfuricans und Desulfonatronovibrio hydrogenovorans, beides Stämme, die durch niedrige Schwefelisotopenfraktionierungen charakterisiert sind (delta34S größer/gleich - 13.2 Promill), stiegen während des Wachstums im 18O-angereicherten Medium die delta18O Werte im restlichen Sulfat nur um etwa 50 Promill. Im Gegensatz dazu zeigte das residuale Sulfat bei Desulfobacca acetoxidans und dem Stamm TRM1 (epsilonS kleiner/gleich - 22.7 Promill) einen 18O Anstieg nahe dem delta-Wert des angereicherten Wassers von + 700 Promill. In den Experimenten mit 18O-abgereichertem Wasser blieben die Sauerstoffisotopenwerte im residualen Sulfat für die Stämme Desulfovibrio desulfuricans, Desulfobacca acetoxidans und Desulfonatronovibrio hydrogenovorans verhältnismässig konstant. Nur der Stamm TRM1, der sich durch den negativsten Anreicherungsfaktor in den Schwefelisotopen auszeichnet (epsilonS kleiner/gleich - 38.7 Promill), zeigte leicht abnehmende delta18O Werte. Die Ergebnisse weisen verstärkt darauf hin, dass die Sauerstoffatome des Sulfats mit denen des umgebenden Wassers während der Sulfatreduktion ausgetauscht werden. Jedoch findet dies weder im Sulfat selbst noch während der Bildung von APS (Adenosin-5-Phosphosulfat) statt, sondern in den Intermediaten des Sulfatreduktionspfades. Es wird angenommen, dass Letzere teilweise zu Sulfat reoxidiert werden. Diese Reoxidation führt wiederum zu einem Einbau von Sauerstoff aus dem Wassermolekül in das „recyclete“ Sulfat und verändert dadurch die gesamte 18O Isotopenzusammensetzung der übrigen Sulfatfraktion. Die Studie zeigt, dass diese 18O Inkorporation während der Sulfatreduktion mit dem Isotopenanreicherungsfaktor für Schwefel korreliert. Diese Reoxidation der Zwischenprodukte der Sulfatreduktion hat auch starken Einfluss auf die Schwefelisotopenfraktionierung und ist wahrscheinlich abhängig von den metabolischen Umsetzungen des Substrats. Daher beeinflusst es indirekt den stabilen Isotopen Anreicherungsfaktor auf eine ratenabhängige Weise.

KAPITEL 2: DER EFFEKT VON NITRIT AUF DIE STABILE ISOTOPENFRAKTIONIERUNG WÄHREND DER BAKTERIELLEN SULFATREDUKTION

Diese Arbeit unterstützt die Erkenntnisse des vorangegangenen Teils. In Batch-Experimenten mit 18O-angereichertem Wasser wurde der Effekt von verschieden hohen Nitritkonzentrationen auf die Schwefelisotopenfraktionierung durch Desulfovibrio desulfuricans untersucht. Mit zunehmenden Nitritkonzentrationen verschoben sich auch die Anreicherungsfaktoren der Schwefelisotopen in Richtung negativere Werte von - 12 Promill auf - 25 Promill. Ferner stiegen auch die delta18O Werte im residualen Sulfat von etwa 50 auf 120 Promill, als das 18O-angereicherte Wasser dem Medium zugegeben wurde. Da ein 18O Austausch mit umgebendem Wasser nicht im Sulfat selbst, sondern eher in den Zwischenprodukten des Sulfatreduktionsweges (z.B. SO32-) stattfindet, wird angenommen, dass Nitrit die Fliessgleichgewichtskonzentration sowie das Ausmaß der Reoxidation des Stoffwechselintermediates Sulfit während der Sulfatreduktion beeinflusst. Von Nitrit ist bekannt, dass es die Produktion des Enzyms zur dissimilatorischen Sulfitreduktion hemmt. In Anbetracht dessen weisen die Ergebnisse darauf hin, dass die Aktivität dieses Enzyms die kinetische Isotopenfraktionierung von Schwefel und Sauerstoff während der Sulfatreduktion reguliert. Diese neuen Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Isotopenfraktionierung während der Sulfatreduktion mehr von der zellinternen Enzymreguliation als von den physiko-chemischen Eigenschaften der einzelnen Enzyme abhängt.

KAPITEL 3: STABILE ISOTOPENFRAKTIONIERUNG WÄHREND DER DENITRIFIKATION DURCH DEN STAMM THAUERA AROMATICA

Batch-Experimente mit der Reinkultur Thauera aromatica wurden durchgeführt, um zum Verständnis der biogeochemischen Regulierungen und Einflussfaktoren der stabilen Isotopenfraktionierung durch die Denitrifikation beizutragen. Die Versuche fanden unter anaeroben Bedingungen mit zwei verschiedenen Kohlenstoffquellen, Acetat und Toluol, und sauerstoffisotopisch markiertem Wasser (deltaWasser ~ + 700 Promill) statt mit dem Ziel, vermeintliche Sauerstoffisotopen Austauschreaktionen von Nitrat mit dem umgebenden Wasser zu untersuchen. Die Experimente mit Acetat als alleinige Kohlenstoffquelle ergaben berechnete Anreicherungsfaktoren für Stickstoff (epsilonN) im residualen Nitrat um - 14 Promill, wohingegen die Anreicherungsfaktoren für Stickstoff (epsilonN) mit Toluol als Elektronendonor, sich um - 20 Promill bewegten. Ferner blieben die delta18O Werte bei letzterem Experiment trotz der Zugabe des 18O-angereicherten Wassers konstant. Die hier präsentierten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Kohlenstoffquelle indirekt die stabile Isotopenfraktionierung des Stickstoffs während der Denitrifikation von Thauera aromatica beeinflusst, da sie offensichtlich die Reaktionsrate reguliert. Die Versuche mit markiertem Wasser gaben zudem keinerlei Hinweis darauf, dass Sauerstoffisotope des residualen Nitrates durch einen Sauerstoffisotopenaustausch und darauffolgender Reoxidation des Stoffwechselintermediates Nitrit beeinflusst werden. Diese Erkenntnisse sind für eine quantitative Bestimmung der in-situ Denitrifikationsraten bedeutsam. Die Arbeit zeigt, dass hohe Fraktionierungen generell während der Denitrifikation erwartet werden können, wenn komplexere Substrate wie aromatische Verbindungen und andere refraktäre Substrate oxidiert werden