Die Rolle der Oberflächensialylierung bei der Modulation von Immunantworten

Abstract

Der Prozess der Glykosylierung stellt eine bedeutende posttranslationale Modifikation von Proteinen dar. Veränderungen im Glykosylierungsmuster von Zellen entstehen zu einem frühen Zeitpunkt der malignen Transformation und tragen zu zahlreichen Prozessen der Tumorigenese wie Adhäsion, Migration und Immunevasion bei. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Glykosylierungsmuster von Tumorzellen und der Einfluss der Sialylierung auf die Modulation von Immunantworten untersucht. Sialinsäurereste stellen die häufigsten terminalen Karbohydrate dar und binden an Siglecs, inhibitorische Rezeptoren, die sich auf Effektorzellen des Immunsystems finden. In der vorliegenden Arbeit wurden durch Klonierung der extrazellulären Domäne von Siglec-7 rekombinante Fusionsproteine generiert. Da die Affinität zwischen einem einzelnem Glykan und Lektin nur sehr gering ist, wurden die rekombinanten Siglec-7 Fusionsproteine in Analogie zu MHC-Tetrameren oligomerisiert und dadurch verlässliche durchflusszytometrische Untersuchungen des zellulären Sialylierungsmusters ermöglicht. Liganden für Siglec-7 konnten auf humanen T-Zellen, Monozyten, NK-Zellen und einer Untergruppe von B-Zellen, die aktivierte und Gedächtnis B Zellen beinhaltet, detektiert werden. Vergleichend hierzu wurden phänotypische Untersuchungen maligner Zellen durchgeführt. Analysen mit Hilfe von Glykanarrays ergaben keine Unterschiede im Glykosylierungsmuster zwischen B Zellen und cALL Blasten. Durchflusszytometrische Untersuchungen mit Siglec-Tetrameren zeigten jedoch, dass T-ALL-Blasten im Gegensatz zu cALL Blasten eine Expression von Siglec-7 Liganden aufweisen. Da Kinder mit T-ALL eine schlechtere Prognose aufweisen als Kinder, die an cALL erkrankt sind, wurde die Hypothese aufgestellt, dass Sialoglykane auf der Oberfläche maligner Zellen als Liganden für Siglecs dienen und eine Inhibition von attackierenden Effektorzellen bewirken können. Als Modellsystem zur Untersuchung der Hypothese wurden K562, die ein klassisches NK Zell Target darstellen und Liganden für Siglec-7 exprimieren, eingesetzt. In Kompetitionsassays wurde die spezifische Lyse von K562 durch NK-Zellen nach Vorinkubation mit rekombinantem Siglec-7 gesteigert. Ähnliche Ergebnisse konnten erzielt werden, wenn primäre leukämische T-ALL Blasten als Zielzellen dienten. Um Vorarbeiten für die Übertragung dieser Ergebnisse auf weitere maligne Erkrankungen zu leisten, wurden Analysen des Sialylierungsmusters von Zelllinien aus Neuroblastomen, Mamma-und Ovarialcarcinomen durchgeführt. Zellen der Neuroblastomlinie SY5Y ergaben eine Expression von alpha2,3-Sialinsäuren, nicht jedoch von alpha2,6-Sialinsäuren. Wurden die Zellen mit den Neurotrophinrezeptoren Trk A oder Trk B transfiziert, so konnte eine erniedrigte Expression von alpha2,3- Sialinsäuren auf Trk B transfizierten Zellen und eine erhöhte Expression von alpha2,6-Sialinsäuren auf Trk A und Trk B transfizierten Zellen im Vergleich zu Transfektionen mit dem Leervektor als Kontrolle detektiert werden. Liganden für Siglec-7 konnten - auch nach Stimulation mit IFNgamma - nur schwach detektiert werden. Mamma- und Ovarial-Carcinom-Linien exprimierten alpha2,3-Sialinsäuren, eine Expression von alpha2,6-Sialinsäuren war hingegen nur auf 2 von 4 untersuchten Ovarial-Carcinom- und 2 von 12 Mamma-Carcinom-Zelllinien zu finden. Liganden für Siglec-7 fanden sich auf 2 Mamma-Carcinom-Linien und auf 3 Ovarial-Carcinom-Linien. In ersten vorläufigen funktionellen Assays wurde eine erhöhte spezifische Lyse von Zellen der Mamma-Carcinom-Linie KS 24.22 nach Zugabe von rekombinantem Siglec-7 in T-Zell-vermittelten Zytotoxizitätsassays detektiert. Darüber hinaus ergaben Analysen des Sialylierungsmuster immunregulatorischer Zellen, dass regulatorische T Zellen und multipotente, mesenchymale Stromazellen Liganden für Siglec-7 auf der Oberfläche aufweisen. Dendritische Zellen regulierten im Laufe ihrer Reifung Liganden für Siglec-7 herunter. Insgesamt wurde die Arbeitshypothese bestätigt, indem gezeigt wurde, dass Sialoglykane auf leukämischen Blasten als Liganden für Siglec-7 auf der Oberfläche von NK-Zellen, dienen können. Dies könnte einen neuen Mechanismus der Immunevasion von malignen Zellen darstellen. Nähere Erkenntnisse sind für die Immuntherapie unterschiedlicher maligner Erkrankungen von Interesse.

Glycosylation is an important posttranslational modification of proteins. Changes in the glycosylation pattern of cell surface proteins occur during early stages of malignant transformation. These alterations in the glycan repertoire may contribute to numerous processes of tumour cell survival such as adhesion, migration and immune evasion. The glycosylation pattern of tumour cells and the influence of sialylation on the modulation of immune responses have been analysed in this dissertation. Sialic acid is the most common terminal carbohydrate moiety of glycan structures in humans binding to a family of receptors termed sialic acid binding immunoglobulin-like lectins (siglecs). Siglecs are expressed on virtually all effector cells of the immune system and several members function as inhibitory receptors. In order to analyse the expression of siglec ligands by malignant cells, the extracellular domain of human siglec-7 was cloned. As the interaction of a single glycan and lectin is of low affinity, siglec-7 was oligomerized in analogy to MHC-tetramers in order to increase avidity. This strategy allowed for reliable use of siglec-7 fusion protein in flow cytometry. Expression of siglec-7 ligands was detected on CD4+ and CD8+ T cells as well as on monocytes, NK cells and a subgroup of B cells comprising of activated and memory B cells. Subsequently, the sialylation pattern of malignant cells was analysed. Glycanarray experiments could not detect any differences in the glycosylation pattern of B cells and primary lymphatic blasts from childhood leukaemias. Flow cytometric analyses however revealed that T-ALL blasts express ligands for siglec-7, whereas these ligands were absent from cALL blasts. As cALL is known to have a better prognosis than T-ALL, it was hypothesized that siglec-7 ligands on the surface of leukaemic blasts inhibit NK cells. To test the functional relevance of siglec-7 ligand expression for NK cell-mediated cytotoxicity the myeloid leukaemia cell line K562, which expresses siglec-7 ligands, was used as a model. In competition assays NK cell-mediated specific lysis increased in the presence of soluble siglec-7. Similar results were obtained using primary leukaemic T-ALL blasts as targets. Further experiments implied analyses of neuroblastoma, mamma carcinoma and ovarial carcinoma cell lines. Cells of the neuroblastoma cell line SY5Y expressed alpha2,3-linked sialic acid but no alpha2,6-linked sialic acid or siglec-7 ligands on their surface. After transfection with neurotrophin receptors Trk A or Trk B expression of alpha2,3-linked sialic acid decreased whereas expression of alpha2,6-linked sialic acid increased in comparison to mock transfected cells. Stimulation with IFNgamma did not influence the sialylation pattern of these cells. Mamma- and ovarial carcinoma cell lines expressed alpha2,3-linked sialic acid. Expression of alpha2,6-linked sialic acid could only be detected on 2 of 4 ovarial carcinoma cell lines and on 2 of 12 mamma carcinoma cell lines. Preliminary cytotoxicity assays showed an increased T cell-mediated specific lysis of cells of the mamma carcinoma cell line KS24.22 in the presence of recombinant soluble siglec-7. Analyses of the sialylation pattern of immunoregulatory cells revealed that regulatory T cells as well as multipotent mesenchymal stroma cells express siglec-7 ligands on their surface. Dendritic cells downregulated ligands for siglec-7 after maturation with proinflammatory cytokines. Taken together these results show that engagement of inhibitory siglecs on the surface of effector cells with sialic-acid conjugated proteins on malignant cells might contribute to immune escape mechanisms. Further results could have important implications for the immune therapy of malignant diseases.