Funktion einer HAMP-Domäne in der Signaltransduktion am Beispiel der mykobakteriellen Adenylatcyclase Rv3645

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-33007
http://hdl.handle.net/10900/49148
Dokumentart: Dissertation
Date: 2008
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Pharmazie
Advisor: Schultz, J. E. (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2008-02-22
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
Keywords: Adenylatcyclase , Tuberkelbakterium , Signaltransduktion
Other Keywords: HAMP-Domäne , Rv3645 , Mycobacterium tuberculosis
HAMP domain , Adenylyl cyclase , Mycobacterium tuberculosis , Rv3645 , Signal transduction
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Inhaltszusammenfassung:

Das Holoenzym Rv3645 von Mycobacterium tuberculosis besteht aus einem hexahelikalen Membrananker, einer sich unmittelbar an die sechste Membranspanne anschließenden HAMP-Domäne und einer C-terminalen Adenylatcyclase (AC). Die HAMP-Domäne aus M. tuberculosis Rv3645 konnte im löslichen Protein gegen die HAMP-Domäne Af1503 aus Archaeoglobus fulgidus ausgetauscht werden, deren Struktur (durch NMR) bekannt geworden war. Der Austausch von HAMP ergab eine enzymatisch aktive Chimäre (WT); dadurch konnte der HAMP-Domäne aus A. fulgidus, die keinen C-terminalen Effektor hat, eine Funktion nachgewiesen werden. Der Zustand von HAMP Af1503 wurde als angeschaltet angenommen. Durch die kinetische Charakterisierung der Chimäre konnte dies bestätigt werden. Dadurch konnte die Annahme, HAMP Af1503 unterliege während der Signalweiterleitung einem Rotationsmoment, wobei sich die vier Helices jeweils um 26° aufeinander zudrehen, näher untersucht werden. Das gelang durch Mutationen an Position A291 der HAMP Af1503: AC Rv3645 konnte die durch die Mutationen veränderten Zustandswahrscheinlichkeiten der HAMP-Domäne wiedergeben. Durch direkte Korrelation der Vmax (AC) mit dem Seitenkettenvolumen der mutierten Aminosäuren an Position 291 der HAMP-Domäne konnte das Drehmoment bestätigt werden. Auch die ATP-Affinitäten der Mutanten ließen einen Drehmechanismus vermuten. Weitere Mutationen belegten zudem, dass Vmax und Km unabhängig voneinander beeinflusst werden. Die in dieser Arbeit hervorgehobene Tatsache, dass sowohl HAMP als auch ACn als Dimere arbeiten, war ein weiterer Beleg für eine konzertierte Rotation der Helices und lieferte gleichzeitig ein 'Ausschlusskriterium' für andere publizierte Mechanismen. Möglicherweise kann der hier postulierte Mechanismus universell angewendet werden. Kristallisationsversuche des löslichen Proteins aus M. tuberculosis wurden unterlassen. Stattdessen wurde die Chimäre WT zur Kristallisation angesetzt. Durch Optimierung der Reinigungsbedingungen konnte das lösliche Konstrukt WT als Dimer kristallisiert werden, dabei wurde die Kristallgröße durch unterschiedliche Pufferzusätze verbessert. Die Auflösung liegt bei 3Å; molecular replacement mit A. platensis CyaC AC war möglich. Die AC aus C. glutamicum Cgl0311 erwies sich als aktiv. Dabei stimmten die Ergebnisse des rekombinanten AC Holoenzyms mit den in-vivo Daten überein. Die Suche nach einem Stimulus für die TM-Region sowie die Aufreinigung des Holoenzyms wurden zugunsten eines geplanten Knock-outs in vivo unterlassen. Die biochemischen Parameter von AC Cgl0311 sowie HAMP-AC Cgl0311 konnten bestimmt, die Einordnung in Klasse IIIb der ACn bestätigt werden. Eine 'Individualität' der HAMP-Domäne in Bezug auf ihre Rezeptordomäne konnte mit dem Serinrezeptor gefunden werden. Offenbar funktioniert eine Signalweiterleitung des Tsr-Rezeptors nur mit dessen eigener HAMP-Domäne, durch Austausch gegen HAMP Af1503 bzw. Rv3645 wurde die Transmitterfunktion unterbrochen.

Abstract:

In signal transduction processes HAMP domains have several functions such as connecting an extracellular sensing to an intracellular signaling domain. Following this general concept Mycobacterium tuberculosis Rv3645 consists of a hexahelical membrane anchor (of which the sensing function is unknown), a HAMP domain and a class IIIb adenylyl cyclase catalytic domain. To investigate the role of the HAMP domain in this system, the HAMP domain of the soluble protein M. tuberculosis Rv3645 was exchanged by a HAMP domain with known structure but without a further cytoplasmatic signaling domain: HAMP from Archaeoglobus fulgidus Af1503. The exchange of HAMP resulted in an enzymatically active chimera in which the cyclase Rv3645 was used as a read-out system for biochemical studies. Kinetic characterization revealed in this construct the HAMP structure to represent the on-state. These results were consistent with the findings from the Archaeoglobus fulgidus Af1503 project (NMR solved structure). Thus a hypothetical rotational mechanism for signal transduction by the HAMP domain was proposed. Mutational analysis of key position Ala 291 of HAMP Af1503 supported plausibly the proposed rotational mechanism. Increasing side-chain volumes of mutated amino acids (Gly, Cys, Val, Leu, Ile, Phe) at position 291 directly correlated with the decrease of maximum velocity of the cyclase. The mutants showed that substrate affinity and maximum velocity were influenced independently. The fact that HAMP and cyclase both require dimerization for activity underlined the rotational mechanism. X-ray analysis of suitable diffracting crystals (3Å) of the chimera will be used for molecular replacement with the class IIIb cyclase of A. platensis CyaC. Furthermore the AC of Corynebacterium glutamicum Cgl0311 was biochemically characterized to have a platform for finding a stimulus for the membrane region in future.

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