Suicidal Erythrocyte Death in Malaria

Abstract

Malaria is one of the most devastating diseases with lethal outcome in more than 1 million humans per year. The course of the disease is not only a function of the pathogen but is heavily influenced by properties of the host. Mechanisms possibly conferring protection against a severe course of malaria include suicidal death of the infected cell. A particular form of suicidal erythrocyte death is eryptosis, which is characterized by Ca2+-entry with subsequent activation of Ca2+-sensitive K+ channels, KCl exit and erythrocyte shrinkage, Ca2+-sensitive scrambling of phospholipids resulting in the breakdown of cell membrane phosphatidylserine asymmetry and phosphatidylserine exposure at the cell surface, as well as Ca2+ dependent activation of calpain, proteolytic degradation of cytoskeletal proteins and cell membrane blebbing. Eryptosis is triggered by different well-known pro apoptotic stressors, namely hyperosmotic shock, oxidative stress and energy depletion, which all activate Ca2+ -permeable nonselective cation channels allowing Ca2+ entry into the erythrocyte. Eryptosis is enhanced in several inherited erythrocyte disorders such as, phosphate depletion, hemolytic uremic syndrome, sepsis, and Wilson disease. As macrophages are equipped with receptors specific for phosphatidylserine, cells exposing phosphatidylserine at their surface will be rapidly recognized, engulfed, degraded and thus cleared from circulating blood

Infection of erythrocytes with Plasmodium falciparum has been shown to trigger eryptosis, at least in part due to activation of host cell channels via oxidation of the cell membrane. Accelerated death of infected erythrocytes has been suggested to delay the development of parasitemia and protect against a severe course of the disease. Erythrocyte death could be triggered by induction of eryptosis. Triggers of eryptosis include hemolysin, PGE2, platelet activating factor, heavy metals like mercury, iron deficiency, L-NAME, Pb(NO3)2 or chlorpromazine. The present studies has been performed to explore whether the addition of L-NAME or Pb(NO3)2 or chlorpromazine to the drinking water may modify the course of malaria and survival of Plasmodium berghei -infected mice and also to explore whether iron deficiency influences the course of malaria.

As a result, iron deficiency increased the phosphatidylserine exposure in P. falciparum infected human erythrocytes, an effect significantly more marked in iron deficiency erythrocytes than compared to control erythrocytes. Moreover, iron deficiency impairs in vitro intraerythrocytic growth and infection of erythrocytes. In mice, iron deficient erythrocytes are more rapidly cleared from circulating blood, an effect increased by infection with P. berghei. Parasitemia in P. berghei infected mice was significantly decreased (from 54% to 33% of circulating erythrocytes, 20 days after infection) and mouse survival significantly enhanced (from 0% to 20%, 30 days after infection) in iron deficient mice.

L-NAME (≥10 µM) increased phosphatidylserine exposure of P. falciparum infected human erythrocytes, an effect significantly more marked than in noninfected human erythrocytes. In parallel, parasitemia in P. berghei infected mice was significantly decreased (from 50% to 18% of circulating erythrocytes 20 days after infection) by addition of L-NAME (1mg/ml) to the drinking water. According to CFSE labelling, L-NAME treated infected erythrocytes disappeared more rapidly from circulating blood than nontreated erythrocytes

Pb(NO3)2 (≥10 µM) increased phosphatidylserine exposure of P. falciparum infected erythrocytes, an effect significantly more marked than in noninfected cells. We further show that Pb(NO3)2 treated erythrocytes are more rapidly cleared from circulating blood than nontreated erythrocytes. Parasitemia in P. berghei infected mice was significantly decreased (from 50% to 18% of circulating erythrocytes 20 days after infection) and mouse survival significantly enhanced (from 0% to 38% 30 days after infection) by addition of 100 µM Pb(NO3)2 (20 ppm) to the drinking water. The treatment did not significantly decrease erythrocyte number and hematocrit in noninfected mice and in infected animals mainly triggered the disappearance of P. berghei harbouring erythrocytes.

Chlorpromazine (≥10 µM) during in vitro infection of human erythrocytes increased phosphatidylserine exposure and decreased forward scatter. Chlorpromazine did not significantly alter intraerythrocytic DNA/RNA amplification but significantly (≥5 µM) decreased in vitro parasitemia. Erythrocytes from chlorpromazine treated mice were more rapidly cleared from circulating blood than nontreated erythrocytes. Parasitemia in P. berghei infected mice was significantly decreased (from 50% to 28% of circulating erythrocytes 22 days after infection) and mouse survival significantly enhanced (from 0% to 80% 30 days after infection) upon addition of 1mM chlorpromazine to the drinking water from the first day of infection.

In conclusion, iron deficiency, L-NAME, Pb(NO3)2 or chlorpromazine enhances the susceptibility of eythrocytes to eryptosis. As a result, erythrocytes undergo accelerated eryptosis following infection with Plasmodium. The accelerated eryptosis precedes the full intraerythrocytic maturation of the pathogen and thus blunts the increase of parasitemia. The observations support the view that accelerated suicidal death of infected erythrocytes is a host mechanism to counteract infection with the intracellular pathogen. The observations may not only serve to understand the mechanisms of host defence against the malaria pathogen but open new perspectives for pharmacological treatment of this devastating disease.

Malaria ist eine verheerende tödliche Krankheit, die jährlich über eine Million Menschen das Leben kostet. Der Verlauf dieser Krankheit ist nicht nur vom Erreger abhängig, sondern wird auch von bestimmten Merkmalen des Erkrankten stark beeinflusst. Möglicherweise verleihen gewisse Mechanismen Schutz vor einem schweren Verlauf der Malaria und der Selbstzerstörung der infizierten Zelle. Eine bestimmte Form des Erythrozytenselbstmordes ist die so genannte Eryptose, welche durch einen Ca2+-Einstrom mit anschließender Aktivierung eines Ca2+-sensitiven K+-Kanals, KCL-Ausstrom und Zellschrumpfung und Ca2+-abhängige Aktivierung von Phospholipiden, charakterisiert ist. Die Aktivierung von Phospholipiden hat zur Folge, dass die Anordnung der Membranphospholipide zusammenbricht und Phosphatidylserine auf der Membranaußenseite präsentiert werden. Zusätzlich kommt es zu einer Ca2+-abhängigen Aktivierung von Calpain, zum proteolytischem Abbau von Cytoskelettproteinen und zur Membranauflösung. Eryptose wird ausgelöst von verschiedenen wohlbekannten apoptotischen Stimuli, zu denen der hyperosmotische Schock, oxidativer Stress und Energiemangel gehören. Diese aktivieren jeweils einen unselektiven Ca2+-permeablen Kationen-Kanal durch den Ca2+ in die Zelle einströmen kann. Eryptose ist beispielsweise verstärkt nachzuweisen bei verschiedenen angeborenen Erythrozytendefekten, Phosphatmangel, HUS (hämolytisch urämisches Syndrom), Sepsis und Morbus Wilson. Da Makrophagen mit speziellen Phosphatidylrezeptoren ausgestattet sind, können sie Zellen, welche Phosphatidylserin auf ihrer Oberfläche präsentieren, erkennen, aufnehmen, abbauen und auf diese Weise aus dem zirkulierenden Blut entfernen.

Es konnte gezeigt werden, dass eine Infektion mit Plasmodium falciparum Eryptose auslösen kann. Teilweise erfolgt dies durch die Aktivierung von Kanälen der infizierten Zelle durch Oxidation der Zellmembran. Beschleunigter Zelltod infizierter Erythrozyten geht einher mit einer Verzögerung der Entwicklung einer Parasitämie und schützt vor einem schweren Verlauf der Krankheit. Erythrozytenzelltod könnte durch die Induktion der Eryptose ausgelöst werden. Faktoren, die Eryptose verursachen, sind Hämolysin, PGE2, PAF (Plättchen aktivierender Faktor), Schwermetalle wie Quecksilber und Blei (Pb(NO3)2), Eisenmangel, L-NAME oder Chlorpromazine. Die vorliegende Studie wurde durchgeführt um erklären zu können, ob die Zugabe von L-NAME, Pb(NO3)2 oder Chlorpromazine zum Trinkwasser den Verlauf der Malaria und das Überleben von mit Plasmodien berghei-infizierten Mäusen beeinflusst und ob Eisenmangel die Schwere des Verlaufs der Krankheit beeinflussen kann. Eisenmangel erhöhte tatsächlich die Phosphatidylserinexposition bei mit P. falciparum infizierte Erythrozyten. Der Effekt, der bei Eisenmangelerythrozyten gemessen werden konnte, war signifikant erhöht im Vergleich zu den Kontrollzellen. Darüber hinaus beeinträchtigt Eisenmangel in vitro intraerythrozytäres Wachstum und Infektion der Erythrozyten. In Mäusen werden Eisenmangelerythrozyten schneller aus dem zirkulierenden Blut entfernt, ein Effekt, der durch eine Infektion mit P. berghei noch verstärkt wird. Die Parasitämie bei mit P. berghei infizierten Mäusen nahm signifikant ab (von 54% auf 33% der zirkulierenden Erythrozyten, 20 Tage nach Infektion) und die Überlebenszeit der Eisenmangel-Mäuse war im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verlängert (von 0% auf 20%, 30 Tage nach Infektion).

L-NAME (≥ 10µM) erhöhte die Phosphatidylserinexposition von P. falciparum infizierter menschlicher Erythrozyten signifikant im Vergleich zu nichtinfizierten. Gleichzeitig war die Parasitämie in P. berghei infizierten Mäusen durch Zugabe von L-NAME (1mg/ml) zum Trinkwasser signifikant vermindert (von 50% auf 18% der zirkulierenden Erythrozyten 20 Tage nach Infektion). Dazu übereinstimmend zeigten Versuche mit CFSE-Markierung, dass L-NAME behandelte infizierte Erythrozyten schneller aus dem zirkulierenden Blut beseitigt werden als unbehandelte Erythrozyten.

Pb(NO3)2 (≥ 10 µM) erhöhte im Vergleich zu nichtinfizierten Zellen die Phosphatidylserinexposition P. falciparum infizierter Erythrozyten signifikant. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass mit Pb(NO3)2 behandelte Erythrozyten schneller aus dem peripheren Blut beseitigt werden als unbehandelte. Die Parasitämie bei P. berghei infizierten Mäusen wurde (von 50% auf 18% der zirkulierenden Erythrozyten, 20 Tage nach Infektion) durch den Zusatz von 100µM Pb(NO3)2 (20ppm) im Trinkwasser signifikant vermindert, ebenso verlängerte sich die Überlebenszeit der Mäuse (von 0% auf 38% 30 Tage nach Infektion) signifikant. Durch die Behandlung verringerten sich Hämatokrit und Erythrozytenzahl in beiden Gruppen nicht signifikant, sie führte hauptsächlich zur Beseitigung der P. berghei-haltigen Erythrozyten.

Chlorpromazine (≥10 µM) erhöhte die Phosphatidylexposition während der in vitro Infektion menschlicher Erythrozyten und senkte den Forward Scatter. Chlorpromazine hatte keinen signifikanten Einfluss auf die intraerythrozytäre DNS/RNS-Vervielfältigung, erniedrigte jedoch die in vitro gemessene Parasitämie signifikant (≥5 µM). Die roten Blutkörperchen Chlorpromazine behandelter Mäuse wurden schneller aus dem zirkulierenden Blut beseitigt als die von unbehandelten. Die Parasitämie P. berghei infizierter Mäuse nahm signifikant ab (von 50% auf 28% der zirkulierenden Zellen 22 Tage nach Infektion) nach Zugabe von 1mM Chlorpromazine zum Trinkwasser vom ersten Tag an der Infektion.

Zusammengefasst erhöhen Eisenmangel, L-NAME, Pb(NO3)2 oder Chlorpromazine die Empfindlichkeit der Erythrozyten gegenüber der Eryptose. Wir kamen zu dem Ergebnis, dass Erythrozyten nach Infektion mit Plasmodien beschleunigt eryptotisch werden. Die forcierte Eryptose erschwert die komplette intraerythrozytäre Reifung des Erregers und verhindert so ein Ansteigen der Parasitämie. Die Beobachtungen unterstützen die Ansicht, beschleunigter selbstinduzierter Zelltod infizierter Erythrozyten könnte ein Mechanismus des Wirts sein, der Infektion mit dem intrazellulären Erreger entgegenzuwirken. Sie könnten nicht nur dazu dienen, die Abwehrmechanismen des Wirts gegen den Malariaerreger zu verstehen, sondern auch neue Perspektiven für die pharmakologische Behandlung dieser verheerenden Krankheit bieten.