Die GAF-Domänen der humanen Phosphodiesterase 10

Abstract

Der Ligand der PDE10A GAF-Domänen war vor dieser Arbeit noch unbekannt. Durch die Erzeugung einer funktionellen Chimäre aus dem N-Terminus und den beiden GAF-Domänen der humanen PDE10A sowie der PAS- und katalytischen Domäne der Adenylatcyclase CyaB1 aus Anabaena war es möglich, cAMP als Ligand des PDE10 GAF-Tandems zu bestimmen. Durch dieses Testsystem war eine Trennung von Ligand und Substrat der PDE möglich. Als ligandenbindende Domäne konnte die GAF-B der PDE10 bestimmt werden. Eine cAMP-Bindung an die GAF-B erfolgte mit einem EC50 von 18 µM, der über der zellulären cAMP-Konzentration liegt. Eine Stimulation der katalytischen Aktivität der AC mit cAMP war um einen Faktor von 15,5 möglich. cGMP dagegen stimulierte nur vierfach. Eine Veränderung der Affinität für cAMP mit den N-Termini der beiden humanen PDE10-Hauptformen PDE10A1 und PDE10A2 zeigte sich nicht. Für die GAF-A wurde keine cAMP- oder cGMP-bindende Funktion gefunden. Eine Bedeutung dieser bei der Dimerisierung ist wahrscheinlich. Ein Entfernen des relativ kurzen PDE10 N-Terminus zeigte keinen Einfluss auf die cAMP-Affinität und unterscheidet sich damit deutlich von den Verhältnissen in der PDE5 oder PDE11. Die Kombination der GAF-A der humanen PDE5A1 mit der GAF-B der humanen PDE10A ist unter Erzeugung einer funktionsfähigen Chimäre mit der CyaB1 AC als Reporterenzym gelungen. Damit konnte eine cGMP-bindende GAF-Domäne mit einer cAMP-bindenden GAF-Domäne gekoppelt werden. Dabei war es irrelevant, welcher N-Terminus sich vor dem GAF-Tandem befand. Mit beiden N-Termini erhielt man funktionsfähige Chimären. Allerdings erfolgte die Stimulation der katalytischen Aktivität der AC vorrangig über cAMP und nicht wie vermutet, verstärkt über cGMP. In diesen Chimären ist die PDE10 GAF-B offensichtlich die ligandenbindende Domäne. Damit scheint die PDE5 GAF-A in gewisser Weise die Funktion der GAF-A der PDE10 zu übernehmen. Dennoch nicht ohne einen gewissen Einfluss auf die Affinität und Stimulation mit cAMP, denn die Affinität erhöhte sich auf 7 µM cAMP unter Verringerung der maximalen Stimulation. Ein Ersetzen des PDE10 Linkers in dieser PDE5-PDE10-CyaB1-Chimäre führte zum Verlust der Stimulation der katalytischen Aktivität der AC mit cAMP und cGMP. Damit nimmt der Linker eine Schlüsselrolle beim Signalisieren über die GAF-Domänen ein. Chimären aus den nicht-bindenden GAF-Domänen der PDE5 und PDE10 waren wie erwartet nicht stimulierbar. Eine Kristallisation des PDE10 GAF-Tandems war mit und ohne cAMP möglich. Allerdings konnte mit den erhaltenen Kristallen nicht die Struktur der GAF-Domänen aufgeklärt werden.

The ligand for the PDE10A GAF domains was unknown before this work. By constructing a functional chimera consisting of the human PDE10A tandem GAF domains including their N-terminus and the PAS and catalytic domain of the cyanobacterial CyaB1 adenylyl cyclase it was possible to determine cAMP as a ligand for the PDE10 GAF domains. In this PDE-cyclase chimera the ligand (cAMP) and the substrate (ATP) differ. PDE10A GAF-B binds cAMP with an EC50 of 18 µM, which is higher than the cellular cAMP concentration. The PDE10 GAF domains activate the associated AC 15.5-fold via cAMP and only 4-fold via cGMP. There was no change in the affinity for cAMP with the different N-terminal regions of the human PDE10 major isoforms PDE10A1 and PDE10A2. For PDE10A GAF-A no function concerning cAMP- or cGMP-binding was found. It is likely that GAF-A could be involved in dimerization. A removal of the relatively short PDE10A N-terminus had no effect on the cAMP-affinity of the GAF-domains, what is strongly different from PDE5 or PDE11. In this work I could show that it is possible to combine the human PDE5A1 GAF-A with the human PDE10A GAF-B in a functional chimera with the CyaB1 AC as a reporter enzyme. That means a cGMP-binding GAF domain (PDE5 GAF-A) was coupled with a cAMP-binding GAF domain (PDE10 GAF-B). In this case it was unimportant, which N-terminus was located in front of the GAF tandem. With the PDE5 as well as with the PDE10 N-terminus the chimera was working. However in both chimeras the activation of the catalytic domain of the AC was higher with cAMP than with cGMP. In these PDE5-PDE10-CyaB1 chimeras PDE10 GAF-B binds cAMP (EC50=7 µM). Interestingly, the substitution of the PDE10 linker between the PDE5 GAF-A and the PDE10 GAF-B by the PDE5 linker resulted in a completely loss of the activation of the AC by cAMP and cGMP. This shows an importance of the linker for the GAF-signalling. It was possible to crystallize the human PDE10 tandem GAF domains with and without their ligand cAMP, but with the received crystals it was impossible to solve the structure of the GAF tandem.