Molekularbiologische Untersuchungen zur Biosynthese der Aminocoumarin-Antibiotika Clorobiocin und Coumermycin A1

Abstract

Die Aminocoumarin-Antibiotika Clorobiocin, Novobiocin und Coumermycin A1 werden von unterschiedlichen Streptomyceten Stämmen gebildet und sind Hemmstoffe der bakteriellen DNA-Gyrase. Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen der Aminocoumarinbiosynthesegencluster haben zu einem detaillierten Verständnis über die Biosynthese dieser Antibiotika geführt. So konnte für nahezu alle Gene des Clorobiocingenclusters eine katalytische, regulatorische oder an Resistenzmechanismen beteiligte Funktion bewiesen werden. Lediglich für das Gen cloY fehlte eine Funktionszuordnung. cloY gehört zur Gruppe der sog. mbtH-ähnlichen Gene. Heute liegen mehr als 106 Datenbankeinträge solcher mbtH-ähnlichen Gene vor, jedoch sind kaum Informationen über deren Funktion zu erhalten. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit Untersuchungen zur Funktion des mbtH-ähnlichen Gens cloY in der Clorobiocin Biosynthese und zeigt erstmals die Notwendigkeit eines Vertreters dieser Genfamilie für die Biosynthese eines Sekundärstoffwechselprodukts auf. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit befasste sich mit der heterologen Expression des Biosynthesegenclusters von Coumermycin A1. Die Biosynthesegencluster der Aminocoumarin-Antibiotika Clorobiocin und Novobiocin wurden bereits erfolgreich kloniert und im Genom des heterologen Produzenten S. coelicolor M512 exprimiert. Da jedoch kein Cosmid mit dem vollständigen Coumermycin A1-Gencluster zur Verfügung stand, war die heterologe Expression von Coumermycin A1 bisher nicht möglich. Zur Lösung dieses Problems, beschreibt die vorliegende Arbeit eine Strategie mit der das vollständige Coumermycin A1-Genclusters erfolgreich auf einem Cosmid kloniert wurde und heterolog exprimiert werden konnte. Die anschließende gentechnische Modifikationen des Biosynthesegenclusters und die Verwendung heterologer Expressionssysteme führten zur Produktion von neuen Strukturanaloga von Coumermycin A1 die hinsichtlich ihrer antibakteriellen Eigenschaften weiter untersucht wurden.

In the biosynthetic gene cluster of the aminocoumarin antibiotic clorobiocin, the small open reading frame cloY codes for a 71 amino acid protein which shows significant sequence similarity to mbtH from the mycobactin biosynthetic gene cluster of Mycobacterium tuberculosis. mbtH-like genes are frequently found in the biosynthetic gene clusters of peptide antibiotics and siderophores, but their function has remained enigmatic. The present thesis focus the function of the small mbtH-like gene cloY in clorobiocin formation and reports the proof of the requirement of an mbtH-like gene for secondary metabolite formation. Furthermore, it is shown that mbtH-like genes from different gene clusters can functionally replace each other. Many secondary metabolites of clinical importance have been isolated from different Streptomyces species. Since most of the natural producers remain difficult to handle genetically, heterologous expression of an entire biosynthetic gene cluster in a well characterised host allows improved possibilities for modifications of the desired compound by manipulation of the biosynthetic genes. However, the large size of a functional gene cluster often prevents its direct cloning into a single cosmid clone. This thesis describes a successful strategy to assemble the entire coumermycin A1 biosynthetic gene cluster onto a single cosmid clone by using the λ RED recombination technology. Heterologous expression of the reconstituted gene cluster in Streptomyces coelicolor M512 resulted in the heterologous production of coumermycin A1. Further experiments including gene inactivation and heterologous expression systems allowed the formation of new hybrid antibiotics which were tested to their antibacterial activity in an agar diffusion assay.