Funktion von Synphilin-1 bei der Pathogenese des Morbus Parkinson - Charakterisierung im Mausmodell und Auffinden neuer Interaktionspartner mittels Yeast 2-Hybrid Technologie

Abstract

Bei der Parkinson'schen Krankheit (PK) handelt es sich, nach der Alzheimer'schen Krankheit, um die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung beim Menschen. Neuropathologisch ist sie durch den Verlust dopaminerger Neurone in der Substantia nigra pars compacta (SNpc) im Mittelhirn charakterisiert. Dies führt durch Verlust des Gleichgewichts zwischen den Neurotransmittern Dopamin und Acetylcholin im Striatum zu den Kardinalsymptomen der PK: fakultativer Tremor, akinetisch-rigide Bewegungsstörung sowie ein reduzierter Stellreflex. Durch die Identifizierung von Krankheitsgenen, die ursächlich für familiäre Formen der PK sind, konnten neue Einblicke in die Pathogenese der PK gewonnen werden. Dabei trat auch Synphilin-1 in den Blickpunkt der Parkinson-Forschung, da es mit den beiden Parkinson-relevanten Proteinen alpha-Synuklein und Parkin interagiert. Des Weiteren konnte Synphilin-1 in für Parkinson typischen Proteinaggregaten, sog. Lewy-Körperchen, nachgewiesen werden und in zwei sporadischen Parkinson-Patienten wurde jeweils an Postition 621 ein Aminosäureaustausch von Arginin zu Cystein (R521C) detektiert. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung der Funktion dieses Protein, die zu Beginn der Promotion noch ziemlich unbekannt war. Dazu wurden zwei verschiedene Methoden verwendet: Die erste Methode bestand in der Generierung transgener Mäuse, die sowohl Wildtyp Synphilin-1 als auch mutiertes R621C Synphilin-1 exprimieren. Für die Expression wurde jeweils die hinteren 3,4 kb des humanen Prionenproteinpromoters verwendet. Mit diesen Tieren wurden Verhaltensstudien durchgeführt. Dabei überquerten die transgenen Mäuse im sog. beam-walking-test signifikant langsamer als Kontrollmäuse einen runden Stab mit einem Durchmesser von 5 mm. Der Grund dafür könnte im Absterben sog. Basket Cells im Cerebellum liegen und die Purkinje Zellschicht versorgen. Dies konnte in histologischen Färbungen nachgewiesen werden. Außerdem konnten in weiteren Gehirnschnitten Proteinaggregate mit einem Synphilin-1-Antikörper in der Substantia Nigra nachgewiesen werden, die wie Perlenketten aufgereiht sind. Auch dies könnte zu einer Funktionsstörung der Willkürmotorik führen. In weiteren Versuchen mit diesen beiden transgenen Tiere wurden Unterschiede sowohl im Expressionsverhalten von weiteren Proteinen mittels Affymetrix-Chips-Technologie im Gehirn bestimmt, als auch die Konzentration der Neurotransmitter von Dopamin bzw. Serotonin und ihrer Metaboliten mittels reverse phase HPLC im Striatum und der SNpc analysiert. Der zweite Teil dieser Dissertation beschäftigt sich mit dem Auffinden neuer Interaktionspartner von Synphilin-1 mittels der Yeast 2-Hybrid-Technologie (Y2H). Dazu wurde im ersten Schritt ein Screening mit einer cDNA-library aus dem Gehirn durchgeführt und der Interaktionsbereiches der aufgefundenen Proteine genauer begrenzt. Da Synphilin-1 selbstaktivierend ist, wurde auf die ersten 176 Aminosäuren verzichtet. Außerdem wurden vier Strukturproteindomänen (Ankyrin-like repeats) des Proteins entfernt, um so unspezifische Interaktionen ausschließen zu können. So konnten drei neue Proteine aufgefunden werden: HAPIP/Duo, Periphilin und die katalytische Untereinheit der Proteinphosphatase 1. Die Interaktion zwischen HAPIP/Duo wurde genauer charakterisiert. In verschiedenen Y2H-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass das vollständige Synphilin-1 Protein mit dem N-Terminus von HAPIP/Duo interagiert. Der Bereich von Synphilin-1 der für die Interaktion notwendig ist konnte auf den N-Terminus ab Aminosäure 557 festgelegt werden. Eine genauere Eingrenzung des Bereiches bei HAPIP/Duo war jedoch nicht möglich. Dies könnte an der Tertiärstruktur von HAPIP/Duo liegen. Dennoch ist mit dem Auffinden der Interaktion zwischen HAPIP/Duo eine molekulare Brücke zwischen den neurodegenerativen Krankheiten PD und Chorea Huntington geschlagen werden. Ein weiteres Projekt bestand in der Durchführung einer Mutationsanalyse von SIAH-1. Das Protein SIAH-1 ist genauso wie Parkin eine E3-Ligase, die Synphilin-1 ubiquitiniert. Mittels der WAVE-Technologie wurden 156 sporadische und 56 familiäre Patienten auf eine Mutation hin untersucht. Nur in einem Patienten konnte eine heterozygote stille Mutation an Position 531 (C531A) detektiert werden. Aus diesem Grund schlossen wir Mutationen in SIAH-1 als häufige Ursache für die PK aus.

Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease by human beings besides Alzheimer's disease. The disease is characterized neuropathological through a lost of dopaminergic neurons in the Substantia Nigra pars compacta (SNpc) in the midbrain. This yields in an imbalance of the neurotransmitter Dopamine and Acetylcholine in the Striatum and from this it follows the main symptoms: facultative tremor, akinesic-rigid movement disorder as well as a reduced startle reflex. By identification of genes causative for this disease, new insights in the pathogeneses of PD could be gained. Thereby Synphilin-1 attracted notice to the Parkinson research, because it interacts with both Parkinson relevant proteins alpha-Synuclein and Parkin. Furthermore, Synphilin-1 was detected in protein aggregates, a typical hallmark of PD, so-called Lewy bodies, and a mutation on position 621 an aminoacid exchange from Arginine to Cysteine (R621C) was detected in two sporadic Parkinson patients. This PhD-thesis characterizes the function of this protein, which was at the beginning of the PhD-thesis quite unknown. For this reason two methods were used. First transgenic mice were generated, expressing both wildtype and mutated R621C Synphilin-1. To express the proteins the last 3,4 kb of the human prion protein promoter was used. With these mice behavior studies were conducted. They transferred a bar with a circle flat with a diameter of 5 mm significantly slower than control mice. This could be cause by the dying of the basket cells in the cerebellum, which supply the Purkinje cells. This was proved in histological staining. Moreover in the Substantia Nigra protein aggregates could be detected using a Synphilin-1 antibody, which are strung like a pearl necklet. This could also induce the dysfunction of the motor functions. In further experiments the differences of both transgenic mice were examined. The protein expression pattern in the brain were determined using Affymetrix-chips-technology as well as the concentration of the neurotransmitter dopamine and serotonin, respectively, and their metabolites via reverse phase HPLC in the Striatum and in the Substantia Nigra pars compacta. In the second part of this PhD-thesis we were looking for new proteins interacting with Synphilin-1 using yeast 2-hybrid technology (Y2H). The first step was a screening using a cDNA brain library and afterwards limiting the region, in which this interaction takes place. Unfortunately Synphilin-1 was self activating. Therefore the first 176 amino acids were deleted. The four structure domains of the protein (Ankyrin-like repeats) were also deleted to exclude unspecific interactions. Three new proteins interacting with Synphilin-1 were detected: HAPIP/Duo, Periphilin und die katalytische Untereinheit der Proteinphosphatase 1. The interaction of HAPIP/Duo was characterized in more details. It could be demonstrated in several Y2H-experiments that full length Synphilin-1 interacts with the N-terminus of HAPIP/Duo. The sufficient region of Synphilin-1 for interaction is the N-terminus starting with amino acid 557. But a narrower region could not be defined. That could be due to the tertiary structure of HAPIP/Duo. Nevertheless it was possible to build a molecular bridge between the two neurodegenerative diseases: Parkinson's disease and Morbus Huntington. A further project was a mutation screening of SIAH-1. This protein is as well as Parkin an E3-ligase and ubiquitinates Synphilin-1, too. 156 sporadic and 56 familial patients were analyzed using WAVE-technology. There was only in one patient a silent heterozygotic mutation at position 531 (C531A) detectable. Therefore we exclude mutations in SIAH-1 as common cause of PD.