Arzneistoffabsorption in Caco-2/TC7 Zellen: Ibuprofen und der Monocarboxylat-Transporter 1 (MCT1)

Abstract

Im Zusammenhang mit wachsenden biopharmazeutischen Herausforderungen durch neue Wirkstoffe gewinnt die Kenntnis von Absorptionsmechanismen von Arzneistoffen zunehmend an Bedeutung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher die Aufklärung aktiver Transportmechanismen von Arzneistoffen mit Hilfe von Caco-2/TC7 Zellen als in vitro Modell für das gastrointestinale Epithel. Als Modellarzneistoff wird das nicht-steroidale Antirheumatikum (non-steroidal antiinflammatory drug, NSAID) Ibuprofen verwendet, dessen Permeation neben rein passiv transzellulärer Diffusion möglicherweise durch einen Carrier, eventuell den Monocarboxylat-Transporter 1 (MCT1), vermittelt wird. Die Überprüfung dieser Hypothese erfolgt über Permeationsstudien an Caco-2/TC7 Zellen, unterstützt durch eine immunchemische Lokalisierung des MCT1 in diesen Zellen. Die Permeationsstudien werden an Monolayern der Caco-2/TC7 Zellen in Transwells® durchgeführt. Zur vergleichenden Einordnung der erhaltenen Ergebnisse über den Ibuprofen-Transport werden die Schlüsselexperimente parallel mit Propranolol, einem Modellarzneistoff für rein passiv transzelluläre Permeation, durchgeführt. Auf-grund der Untersuchung der Konzentrations- und Temperaturabhängigkeit des Transports von Ibuprofen, des Einflusses des metabolischen Inhibitors Natriumazid sowie des P-gp Substrats Verapamil wird sowohl die passive Komponente der Ibuprofen-Permeation bestätigt als auch ein aktiver Mechanismus erkannt, wobei eine Rolle von P-gp ausgeschlossen werden kann. Ein pH-abhäniger Anstieg der Ibuprofen-Permeation bei pH 6,0 im Donor- und pH 7,4 im Akzeptorkompartiment ist primär der pH-Verteilungstheorie zuzuschreiben, jedoch ist die Beteiligung eines Protonen-abhängigen Carriers nicht auszuschließen. Die konzentrationsabhängige Hemmung des Transports von Ibuprofen durch Benzoesäure, einem bekannten Substrat des MCT1, ist ein starker Hinweis auf die Beteiligung dieses Carriers am Transport von Ibuprofen. Dieses Ergebnis kann für beide Permeationsrichtungen gezeigt werden. Der kompetitive MCT1-Inhibitor α-Cyano-4-hydroxycinnamat (CHC) zeigt jedoch weder einen Effekt auf die Permeationskoeffizienten von Ibuprofen noch auf die von Benzoesäure, was möglicherweise auf die biologische Inaktivität der eingesetzten Charge CHC zurückzuführen ist. Um gemeinsam mit den Ergebnissen der Permeationsstudien weiteren Aufschluss über die Rolle des MCT1 beim Ibuprofen-Transport zu erhalten, soll die zelluläre Verteilung des MCT1-Proteins in den Caco-2/TC7 Zellen bestimmt werden. Zu diesem Zweck wird die Methode der Immunfluoreszenz an unserem Lehrstuhl neu etabliert. Diese besteht in der immunchemischen Markierung des MCT1-Proteins nach der so genannten 2-Schritt indirekten Färbemethode und der anschließenden fluoreszenzmikroskopischen Detektion. Hierfür werden zwei Sets von Primärantikörpern und korrespondierenden Sekundärantikörpern ausgewählt und ein detailliertes Färbeprotokoll wird erstellt. Außerdem kommen verschiedene Fixierungsmethoden zum Einsatz, die ebenso wie die Antikörper hinsichtlich ihrer Eignung in dieser Anwendung überprüft werden. Die Untersuchung der exakten Lokalisation des MCT1 in den Caco-2/TC7 Zellen erfolgt anhand einer Dreifachfärbung von Zellkernen, F-Actin und der Visualisierung des MCT1-Proteins. Durch dieses Vorgehen kann eine valide Aussage über die räumliche Verteilung des MCT1-Proteins in den Caco-2/TC7 Zellen getroffen werden. Es wird gezeigt, dass das MCT1-Protein im Bereich des Bürstensaums und in der lateralen Plasmamembran der apikalen Zellseite lokalisiert ist, wobei beide eingesetzten Primärantikörper, von denen einer bis dahin noch nicht in der Immunfluoreszenz verwendetet wurde, ihre Nützlichkeit in dieser Anwendung unter Beweis stellen. Durch die Zusammenfassung aller Einzelresultate der Permeationsstudien und der Immunfluoreszenz kann schließlich ein Gesamtbild der Transportcharakteristik von Ibuprofen beschrieben werden. Dieses umfasst neben passiver Permeation die Beteiligung des apikal lokalisierten MCT1 am Ibuprofen-Transport.

In the context of growing biopharmaceutical challenges concerning the biopharmaceutical properties of new drugs, the knowledge of drug absorption mechanisms is increasingly gaining in importance. Therefore, the present thesis aims to elucidate active drug transport mechanisms by means of Caco-2/TC7 cells as an in vitro model of the gastrointestinal epithelium. Ibuprofen, a non-steroidal antiinflammatory drug (NSAID) is used as a model compound since its permeability might not only arise from passiv transcellular diffusion but also from a carrier-mediated mechanism, possibly the monocarbolxylate transporter 1 (MCT1). A testing of this hypothesis is conducted on the basis of permeability studies with Caco-2/TC7 cells, supported by the immunochemical localisation of the MCT1 protein in these cells. Permeability studies are performed on monolayers of Caco-2/TC7 cells grown in transwells®. Key experiments of the ibuprofen transport are performed in parallel with Propranolol, a model drug for pure passive transcellular permeation, in order to properly assess the obtained results. By the investigation of the concentration and temperature dependence of the transport of ibuprofen, of the influence of the meta-bolic inhibitor sodium azide and of the P-gp substrate verapamil, the pasive component of the ibuprofen permeability is confirmed as well as an active mechanism is identified, whereas a role of P-gp can be ruled out. A pH-dependent increase of the ibuprofen permeation at pH 6.0 in the donor and pH 7.4 in the acceptor compartment is primariliy due to the pH-partitioning theory, although the involvement of a proton-dependent carrier is not to be excluded. The concentration-dependent bidirectional inhibition of the ibuprofen transport by benzoic acid, a known substrate of the MCT1, strongly indicates the involvement of this carrier in the transport von ibuprofen. However, the competitive MCT1 inhibitor α-cyano-4-hydroxycinnamat (CHC) doesn´t show any effect on the permeability coefficients of neither ibuprofen nor benzoic acid, which might possibly be due to the biological inactivity of the used batch of CHC. Based on the results of the permeability studies the elucidation of the cellular distribution of the MCT1 protein in Caco-2/TC7 cells is aimed to give further information about the role of the MCT1 in the transport of ibuprofen. For this purpose, an immunofluorescence method is established in our department. It consists of the immunochemical labelling of the MCT1 protein according to the 2-step indirect staining method and detection via fluorescence microscopy. Two sets of primary and corresponding secondary antibodies are chosen and a detailed staining protocol is compiled. Furthermore, two different fixation methods are applied and their suitability is evaluated. The investigation of the exact localisation of the MCT1 in Caco-2/TC7 cells is conducted by a tricolour staining including the cell cores, F-actin and the visualisation of the MCT1 protein. This procedure allows a basis of valuation regarding the spatial distribution of the MCT1 protein in Caco-2/TC7 cells. The results show that the MCT1 protein is localised in the brush boarder region and in the lateral plasmamembrane of the apical side of the cells, whereas both primary antibodies, even one that was not used in immunofluorescence studies before, proved their suitability. Summarizing the results of the permeability studies and the immunofluorescence, an overall picture of the transport characteristics of ibuprofen can be described. It includes passive permeation and the involvement of the apical localised MCT1 in the transport of ibuprofen.