Charakterisierung der VFB F-Box Protein Familie aus Arabidopsis thaliana

Abstract

Der durch Ubiquitin vermittelte Abbau von Proteinen stellt einen wichtigen Regulierungsmechanismus in eukaryotischen Organismen dar. Für den Abbau bestimmte Proteine werden mit einer Polyubiquitinkette markiert. Diese wird durch eine Kaskade aus drei Enzymen bzw. Enzymkomplexen gebildet: dem Ubiquitin aktivierenden Enzym (E1), dem Ubiquitin konjugierenden Enzym (E2) und der Ubiquitin Ligase (E3). Für die Spezifität des Prozesses ist die E3 Ligase zuständig, die als Substratrezeptor fungiert. Eine Form von Ubiquitin Ligasen stellen SCF Komplexe dar, die aus SKP1, CULLIN1, RBX1 und einem F-Box Protein bestehen. Das F-Box Protein (FBP) kann das abzubauende Substrat erkennen und dem Abbau zuführen. Mehr als 2 % des Arabidopsis thaliana Genoms kodiert für FBPs. Obwohl die große Anzahl an FBPs eine wichtige Rolle bei der pflanzlichen Entwicklung impliziert, sind bis heute nur wenige von ihnen auf ihre Funktion hin untersucht worden.

In einer phylogenetischen Analyse konnte eine Familie von FBPs identifiziert werden, deren vier Mitglieder sich innerhalb der C Subfamilie der Arabidopsis FBP Superfamilie deutlich abgrenzen. Im Rahmen dieser Dissertation sollte die VFB Familie ('Vier F-Box Proteine') charakterisiert werden. Die Mitglieder der Familie gehören zu den Proteinen mit Leucin-reichen Domänen (LRR), bestehend aus der N-terminalen F-Box Domäne sowie 14 C-terminalen LRRs. Letztere fungieren vermutlich als Substraterkennungsdomäne.

Mittels Promotor:GUS Fusionskonstrukten und RT-PCR Analyse konnte gezeigt werden, dass VFB2 und VFB4 stärker exprimiert sind als die beiden anderen Gene, und dass sie über die gesamte Entwicklung der Pflanze hinweg eine wichtige Funktion in verschiedenen Pflanzenorganen haben könnten. In Protoplasten konnte gezeigt werden, dass die Proteine im Zytosol lokalisiert sind und nicht im Nukleus wie andere bekannte FBPs. Im Hefe-2-Hybridsystem wurde die Interaktion mit der SKP1 Untereinheit des SCF Komplexes gezeigt und so die mögliche Existenz eines SCFVFB aufgezeigt. Mittels reverser Genetik wurden weitere Untersuchungen zur biologischen Rolle der VFB Gene durchgeführt. T-DNA Insertionslinien aller vier Gene wurden aus Stammsammlungen bezogen und homozygote Mutanten für VFB1, VFB2 und VFB3 wurden generiert. Da weder die Einzel-, Doppel- noch Dreifachmutanten einen Phänotyp besaßen, wurden zusätzlich RNAi und miRNA Konstrukte gegen VFB4 kloniert und in Pflanzen eingebracht. Die vfb1-1 vfb2-1 vfb3-1 vfb4 (RNAi) bzw. (miRNA) Pflanzen zeigten klare Defekte bei der Ausbildung von Seitenwurzeln und im Wurzelwachstum. Da es sich hierbei um Auxin-vermittelte Phänotypen handelt, wurde durch Einkreuzen der Markerlinien HS:AXR3/IAA17(NT):GUS und DR5:GUS der Phänotyp weiter untersucht. So konnten gezeigt werden, dass die VFBs nicht dieselbe biologische Funktion wie die FBPs TIR1 und AFB 1 bis 3 besitzen. Auch der Test, ob VFB2 das TIR1 F-Box Protein funktionell ersetzen kann, fiel negativ aus. In einem Mircoarrayexperiment wurden aber mehrere fehlregulierte Gene der Auxinantwort in vfb1-1 vfb2-1 vfb3-1 vfb4 (RNAi) Pflanzen festgestellt. Diese überlappten zusätzlich mit fehlregulierten Genen einer Mutante des COP9 Signalosoms. Zusammengenommen konnte gezeigt werden, dass die VFB Proteine für die normale Entwicklung der Pflanze, das Wachstum und die Entwicklung von Seitenwurzeln wichtig sind, aber keine erkennbare Funktion in der Auxinantwort einnehmen.

The ubiquitin-mediated degradation of proteins is an important regulatory mechanism in eukaryotes. Proteins destined for degradation get marked with a polyubiquitin chain. This process is carried out by the successive action of an ubiqutin-activating enzyme (E1), an ubiquitin-conjugating enzyme (E2) and an ubiquitin ligase (E3). The specificity of the process is confered by the E3 ligase containing subunits which function as substrate receptors. One type of E3 ligase is represented by SCF complexes which are composed of SKP1, CULLIN1, RBX1 and an F-Box protein. The F-Box protein (FBP) is the substrate recognition moiety that promotes protein degradation. In Arabidopsis thaliana more than 2 % of the genome encode for FBPs. Although their big number suggests an important role for FBPs in plant development only a small number is well investigated with respect to their function.

In a phylogenetic analysis a family of four FBPs was identified in the C subfamily of the Arabidopsis FBP superfamily, which is distinct from other members of this family. In this project, this family of FBPs named 'Vier F-Box Proteine', VFB, (German for 'Four F-Box Proteins') was characterized. These FBPs belong to the leucin-rich-repeat FBPs that consist of an N-terminal F-Box domain and in this case 14 C-terminal leucine-rich-repeats (LRR), which are supposed to function as the substrate recognition moiety of the protein.

By using promoter:GUS fusions and RT-PCR analysis it was shown that two proteins, VFB2 and VFB4, are more strongly expressed than the others and that they seem to have a function in many plant organs throughout the plant´s life cycle. In protoplasts they were localized to the cytosol and not to the nucleus like many known FBPs. Using the yeast-two-hybrid system, the interaction with the SCF complex component SKP1 was proven and the existence of a SCFVFB complex could be proposed. Using a reverse genetic approach, the role of the VFB genes in plant development was investigated. T-DNA insertion lines for all of the genes were obtained and homozygous mutants for VFB1, VFB2 and VFB3 were generated. Because neither the single, the double nor the triple mutants displayed any obvious phenotype an additional RNAi and miRNA approach was used to knock down VFB4 function. The vfb1-1 vfb2-1 vfb3-1 vfb4 (RNAi) and (miRNA) plants were found to have defects in lateral root development and root growth. Because this is an auxin mediated phenotype, the marker lines HS:AXR3/IAA17NT:GUS and DR5:GUS were crossed to these plants and their expression patterns examined. Here we could show that the VFBs do not have the same function as the related FBPs TIR1 and AFB1 to 3. Additionnally a complementation assay was performed and it was shown that VFB2 is not able to functionally replace TIR1. In a microarray experiment auxin related genes were misregulated in the vfb1-1 vfb2-1 vfb3-1 vfb4 (RNAi) mutants. Those were also overlapping with misregulated genes in a COP9 Signalosome mutant.

In summary, it could be shown that the VFB FBPs are important for regular plant growth and the development of lateral roots but do not act in the known auxin signalling pathway.